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土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法)实验试剂：1、pH7.6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。2、2%酪酸钠溶液:称取2g酪酸钠,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml,继续沸水浴处理,直至完全溶解,用同样的缓冲液定容至100ml。3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。4、0.6mol/L乙酸铅溶液。5、草酸钠—乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸钠溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮,0.02g抗坏血酸,溶于100ml无水乙醇。7、0.2%KIO3溶液。8、pH5.8乙酸—乙酸钠缓冲液:94ml0.2mol/L乙酸钠与6ml0.2mol/L乙酸混合。9、0.01%甘氨酸标准溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀释10倍。10、甲苯。以上试剂均为分析纯。实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50、100、150、200、250、300μl0.01%甘氨酸标准溶液,置于10ml刻度试管中(浓度分别相当于NH20.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639μg/ml),加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1.5ml茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值;以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。2、培养与测定①称取0.200g土壤,加入2mlTris—HCl—CaCl2混合溶液和1ml甲苯,混合均匀后静置15min以抑制微生物活性；②然后再加入5ml2%的酪酸钠溶液,50℃振荡培养2h。对照土壤在培养过程中不加酪酸钠溶液,但在培养结束后加入,且加入的酪酸钠也经历50℃、2h的振荡培养过程。④培养结束并在对照中加入酪酸钠后,充分混合,置于0～4℃冷藏柜中静置30min。取出加入1.5ml0.6mol/L乙酸铅溶液,6000r/min离心10min,取上清液1.5ml,加入457μl草酸钠—乙酸混合溶液,17000r/min再离心10min；⑤小心吸取1ml上清液，置于10ml刻度试管中,加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液,再加入1.5ml茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min,取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值。注:每个土样设置5个重复。结果计算NH2(μg)=a×150式中,a为比色液吸光值在标准曲线上对应的浓度,单位为(NH2μg/ml),150为换算为每个样品NH2总含量的系数。蛋白酶的活性以50℃培养2h,5g土壤中NH2的μg数表示(为便于比较,也可以换算为1g烘干土,表示为NH2μg/g烘干土)。芳基硫酸酯酶的活性测定（比色法）1.方法原理：芳基硫酸酯酶酶促有机硫化物脱硫成为无机形态。基于碱性条件下，芳基硫酸酯酶作用n-硝基酚硫酸酯，比色测定水解生成的酚量表示酶的活性。2.药品及试剂配置：对硝基酚硫酸钾，醋酸，CaCl2·2H2O,NaOH，对硝基酚，甲苯⑴0.005mol/L对硝基酚硫酸酯溶液：0.1287g4-硝基苯硫酸钾（对硝基苯基硫酸钾）溶于醋酸缓冲液（Ph=5.8），并用同一缓冲液将溶液定容至100mL溶液保存在冰箱中。⑵0.5mol/L醋酸缓冲液（Ph=5.8）⑶0.5mol/LCaCl2·2H2O⑷0.5mol/LNaOH⑸n-硝基酚标准溶液：取1g对硝基酚溶于水并定容至1L(1mL含1mg)标准曲线的绘制：取1mL对硝基酚标准溶液稀释至100mL（1mL含10ūg），然后取不同量的稀释液配成系列，用以测定芳基硫酸酯酶活性相同的方法，使对硝基酚显色，比色后制成标准曲线。3.操作步骤：加几滴甲苯1g土壤置于50mL三角瓶----------------------再加4mL醋酸缓冲液（Ph=5.8）-------------加1mL0.005mol/L对硝基酚硫酸酯------摇荡，盖紧，于37℃恒温箱培养1h。培养结束，加1mL0.5mol/LCaCl2和4mL0.5mol/LNaOH，用慢速滤纸过滤，培养混合物，取滤液在分光光度计上于400nm处比色，测定滤液的黄色深度。试验需设无基质对照。其它测定方法土壤芳基硫酸酯酶活性，以1g土壤在1h内释出的对硝基酚的微克数表示。一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，其特征在于：１）分别称取１ｇ－２ｇ鲜土样品２ｎ份分别置于２ｎ个三角瓶中，ｎ≥３，分成二组，每组ｎ个，向２ｎ个三角瓶中加入４－８ｍＬｐＨ＝５．７５－５．８５乙酸缓冲溶液，向第一组ｎ个三角瓶中加入１－２ｍＬ２５－５０ｍｍｏＬ（0.025－0.050mol）.Ｌ-1的底物对硝基苯硫酸钾工作液，第二组ｎ个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放在３６．５－３７．５℃恒温培养中恒温培养１－２ｈ；２）培养结束后，加入４－８ｍＬ０．４９－０．５１ｍｏＬ.Ｌ-1碱性ＴＨＡＭ（三羟基氨基甲烷）溶液和１－２ｍＬ０．４９－０．５１ｍｏＬ.Ｌ-1氯化钙溶液，并向第二组三角瓶中加入１－２ｍＬ２５－５０ｍｍｏＬ.Ｌ-1的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤；３）用分光光度法于410ｎｍ处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度Ａ；以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在４１０ｎｍ测定的吸光值Ａ制作工作标准曲线，得到斜率ｂ；根据吸光值Ａ和斜率ｂ，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度Ｓ，Ｓ＝Ａ＊ｂ；计算样品中对硝基苯酚含量ｍ↓［１］；４）计算磷酸单酯酶酶活性：计算公式为：ｗ＝ｍ↓［１］／（ｍ↓［２］×Ｋ）＝ＳμｇＣ↓［６］Ｈ↓［５］ＮＯ↓［３］.ｇ↑［－１］干土.ｈ↑［－１］式中：ｗ：单位土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；ｍ↓［１］：测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；ｍ↓［２］：鲜土样品质量；ｋ：水分系数，单位重量的烘干土重／鲜土重。过氧化物酶活性分原理过氧化物酶能氧化土壤中的有机物质，过氧化物酶酶促邻苯三酚氧化为醌，用乙醚提取生成紫色没食子素，比色着色的乙醚相，该乙醚相在430nm处有最大光吸收值，采用的是邻苯三酚比色法。步骤（1）标曲的制作：①重铬酸钾标准溶液的配制：称取0.75g重铬酸钾溶于1L0.5mol/LHcl（相当于50mL乙醚中含5mg紫色没食子素）。表4重铬酸钾标准曲线配置②混合均匀后在430nm处比色。③以吸光值为横坐标、没食子素的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即没食子素含量C（mol）=a+b×A430，通过计算得到回归方程为：C（mol）=-0.0005+0.1091A430,R=0.9998,R2=0.9997（2）过氧化物酶活性测定：①称取0.16g砂土于10ml离心管中，加入2mL1%邻苯三酚溶液和0.4mL0.5%H2O2溶液，充分振荡混合均匀，30℃恒温箱培养2小时；②加入0.8mLpH4.5柠檬酸-磷酸盐缓冲液，加入7mL乙醚，充分振荡，萃取30min;③吸取乙醚相液体在430nm处比色。计算方法土壤过氧化物酶活性用每克土中没食子素的毫克数表示，即（g/hgW）=C×V×稀释倍数/（W×t）式中：C—标准曲线上查得样品中没食子素浓度（g/mL）；V—样品反应的总体积（mL）；t—反应时间（h）；W—样品土壤的重量（g）；脲酶（比色法）1.试剂的配制：1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液的配制：368g柠檬酸，加入600mL蒸馏水及295gKOH溶解，混匀并定容至2L，用1mol/LNaOH调PH=3.62）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚，溶于少量乙醇，加入2mL甲醇及18.5mL丙酮，加乙醇稀释至100mL（A液），存入冰箱称取27gNaOH溶于100mL水中（B液）存入冰箱3）次氯酸钠溶液用水稀释制剂，至活性氯浓度为0.9%至溶液稳定4）10%尿素液5）甲苯6）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵，定容至1L，则得1mL含0.1mg氮的标准液，绘制标准曲线时，可再将此液稀释10倍供用。标准曲线绘制：吸取稀释的标准液1，3，5，7，9，11，13mL移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容，1h内在分光光度计上于波长578nm处根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲编号012345678标液/mL00.51.52.53.54.55.56.57.50.5mol/LHcl/mL109.58.57.56.55.54.53.52.5光吸收值\0.040.1320.2280.3170.4050.50.5830.688线。操作步骤：5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯-------------15min后---------加10mL10﹪尿素液和20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液--------摇匀，在37℃恒温箱中培养24h--------过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3—N的毫克数表示.NH3-N（mg）=a*2式中，a-----从标准曲线查得NH3-N毫克数2-----换算成1g土的系数法二土壤脲酶测定（改进的）待测土样风干，过80目筛。精确称取0.200g土样于10ml圆底塑料离心管中，加入0.2ml甲苯，振荡摇匀。15分钟后，加入2ml10%尿素溶液和4mlpH=6.7的柠檬酸盐缓冲液，加盖摇匀，于37℃培养24小时。取出后摇匀，于3800r离心5分钟，吸取上清液0.6ml于10ml试管，加入3.4ml蒸馏水，再加入0.8ml苯酚钠溶液和0.6ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。待30分钟后显色，加入4.6ml蒸馏水，定容至10ml。于1小时内，在578nm下比色，记录光吸收值。标准曲线的绘制：精确称取0.0472g硫酸铵，加蒸馏水溶解，定容至1L，则1ml含0.01mg氮的标准溶液。分别吸取氮的标准溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6ml于10ml离心管中，对照组不吸取氮的标准溶液，分别加入蒸馏水至4ml，再加入0.8ml苯酚钠溶液和0.6ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。待30分钟后显色，加入4.6ml蒸馏水，定容至10ml。于1小时内，在578nm下比色，记录光吸收值。以标准溶液浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。酸性磷酸酶活性测定（一）原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。（二）测定方法①称取壤土0.3g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于50mL离心管中，加入0.2mL甲苯和4mLMUB（MUB即通用缓冲液，pH=6.5），再加1mL0.05mol/L对硝基苯磷酸钠溶液（用MUB配），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5mol/L的CaCl21mL及0.5mol/L的NaOH4mL，摇匀；③而后转入10mL塑料离心管中在2500r/min下离心5min；④取上清液在410nm处比色，并记录吸收光值。