济南市流动采血点A型与B型血小板捐献者HPA-2基因型频率的比较

1济南市流动采血点A型与B型血小板捐献者HPA-2基因型频率的比较安涛1孙秀艳1姚海云1汪运山2（1.山东省血液中心济南血站，山东济南250001；2.济南市中心医院，山东济南250013；）摘要目的：探讨血小板糖蛋白HPA-2基因型在A型和B型血小板捐献者中的分布频率。方法：收集血小板捐献者A型44名，B型44名，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）扩增GPHPA-2基因，产物经限制性内切酶Hin1I消化后确定其基因型。结果：在A型和B型血小板捐献者中，血小板糖蛋白HPA-22a/2a基因型频率分别是0.95、0.91;2a/2b基因型频率分别是0.05、0.07;2b/2b基因型频率分别是0、0.02。结论：血小板糖蛋白HPA-2基因型频率在A型和B型血小板捐献者中的分布无显著性差异。关键词：无偿献血；流动；血小板糖蛋白；HPA-2基因型ABSTRACT:ObjectiveToevaluatethedistributivecharacteristicofgenotypeofplateletglycoproteinHPA-2inthetypeAandtypeBvolunteerplateletdonators.Methods:88volunteerplateletdonatorsatmobileplacewerecollected.HPA-2polymorphismwastestedbypolymerasechainreaction-restrictedfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)amplification.GenotypingforHPA-2wasperformedbyrestrictionenzymeanalysis.Results:TherewasnosignificantdifferencesinHPA-2genotypefrequencyinthetypeAandtypeBvolunteerplateletdonators.Conclusions:ThereisnosignificantdifferenceofHPA-2genotypefrequencyinthetypeAandtypeBvolunteerplateletdonators.Keywords：volunteerplateletdonators；mobility；glycoprotein；HPA-2genotype人类血小板同种异型抗原（humanplateletalloantigen,HPA）是由血小2板糖蛋白携带的一类特异性抗原，又称血小板特异性抗原，其基因具有单核苷酸多态性（SNP）1。血小板膜含有多种糖蛋白（Glycoprotein,GP），构成血小板的各种受体，使血小板发挥止血及有关功能[1]。血小板GP基因上存在人类血小板同种异型抗原系统,每个抗原系统由共显性双等位基因控制。对血小板GPIb的基因序列研究发现，在GPIb基因的受体结合区存在HPA-22a/2b等位基因。血小板GP基因发生变异时，可改变其结构和表达水平，进而影响血小板的黏附和聚集功能[2]。目前，济南市用于临床输注的血小板全部来源于无偿献血人群，并且在本市无偿献血人群中，B型献血者占的比例最高，A型献血者的比例次之。近年来国内外有关HPA-2多态性在血小板捐献者中分布情况的报道很少。本研究应用分组对照分析研究，对血小板GPHPA-2基因型频率在A型和B型血小板捐献者中的分布频率进行分析探讨。1资料和方法1.1资料血小板捐献者88人，为济南市部分血小板捐献者，其中A型44人，B型44人，年龄最小18岁，最大52岁,平均27.7岁,均符合献血者健康体检标准。B型血小板捐献者中的男女比例为1.6:1；A型血小板捐献者的男女比例为1.6:1。每一位血小板捐献者的血小板计数均在140×109/L至260×109/L之间，其血压、血常规、乙肝表面抗原、丙型肝炎抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、丙氨酸氨基转氨酶、血清总胆红素的检测结果全部正常。88名血小板捐献者的资料见表1。表1血小板捐献者的资料血型AB（n=44）（n=44）平均年龄(岁),(范围)28.3(18~52)27.2(18~49)男女比例1.6:1(27/17)1.6:1(27/17)平均血小板计数×109/L212.6209.8舒张压(mmHg)60~9065~85收缩压(mmHg)95~12590~1203乙肝表面抗原阴性阴性丙型肝炎抗体阴性阴性艾滋病病毒抗体阴性阴性梅毒螺旋体阴性阴性丙氨酸氨基转氨酶(U)＜40＜40血清总胆红素正常正常1.2方法(1)标本收集与DNA制备：取外周血2.7ml，立即放入EDTA-K2抗凝采血管中，充分混匀后，用Tiangen公司生产的小剂量DNA提取试剂盒提取外周血DNA。（2）应用PCR-RFLP方法检测HPA-2多态性。PCR引物购自上海博尚展新生物公司，试剂购自宝生物公司。上游引物为：5′-GGACGTCTCCTTCAACCGGC-3′，下游引物为：5′-GCTTTGGTGGGGAACTTGAC-3′[3]。PCR反应体积为20ul，其中分别含有Taq酶（5U/ul）0.2ul，10×PCRBuffer2ul，MgCl2(25mM)1.5ul，dNTPMixture(各2.5mM)0.8ul,上、下游引物各1ul和提取的DNA模板1ul。反应条件为94℃预变性5min后，94℃30s，62℃45s，72℃55s，共36循环，最后1个循环72℃延伸5min。HPA-2多态性检测：反应体积20ul，在8ulPCR产物中加入限制性内切酶Hin1I8U（大连宝生物公司），缓冲液2ul，37℃酶切过夜。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙淀）电泳，紫外灯下观察结果，对PCR产物进行分析。1.3统计学方法：两组间基因型频率比较用卡方检验，P值小于0.05时有显著性差异。研究对象与Hardy-Weinberg遗传平衡规律的符合程度用卡方检验，取检验水准α=0.05。2结果2.1HPA-2多态性分析HPA-2的PCR产物长588bp，经酶切后产生3种基因型：等位基因2a纯合子产生271bp、201bp、116bp3个片段，等位基因2b纯合子产生387、201两个片段，2a/2b杂合子产生387bp、271bp、201bp、116bp4个片段（图1）。4图1HPA-2多态性电泳图M：DNAmarker；2b：2b/2bgenotype；2a/2b：2a/2bgenotype；2a：2a/2agenotype2.2基因型频率分布两种血型血小板捐献者HPA-2基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，其HPA-2基因型频率分布差异无统计学意义（P＞0.9）（表2）。表2A型和B型血小板捐献者中HPA-2基因型分布频率基因型A型B型χ2P2a/2a42(0.95)40(0.91)2a/2b2(0.05)3(0.07)0.007＞0.92b/2b0(0)1(0.02)3讨论人类血小板同种异型抗原分布在血小板糖蛋白上，它具有独特的型特异性，构成血小板膜结构的一部分3。在目前已知的24个HPA抗原中，除HPA-14bw基因是因核苷酸1909至1911位置上AAG3个碱基缺失产生外，其它的HPA基因均具有单核苷酸多态性（SNP）。HPA-2多态性位于血小板GPIb基因序列中，其基因变异可改变相应血小板GP的氨基酸序列而影响血小板GP的蛋白结构[2]。血小板GPIb-V-Ⅸ复合物是血小板上最主要的GP之一，是由4个不同基因控制合成的蛋白质组成的异质多聚体。Ib作为该复合物的组成部分，在止血的起始阶段与血管内膜的vWF（血管假性血友病因子）结合，介导血小板与内皮黏附[4]。GPIb-V-Ⅸ复合物是参与血小板黏附的关键因素，GPIbα作为其功能单位含有vWF和凝血酶的结合位点。HPA-2多态性位于血小板GPIb残基145位点，C（1a）5/T（1b）变异使其编码的氨基酸由苏氨酸变为甲硫氨酸。因HPA-2多态性使血小板GPIb的氨基酸发生改变，且该多态性位于vWF结合区，所以认为它很可能影响血小板GPIb的受体功能[4，5，6]，进而影响其黏附、聚集功能。GPIb-V-Ⅸ复合物可引起同种免疫反应，在临床上引发血小板输注无效等。因此，由于献血者GPHPA-2的二态性而影响血小板输入患者体内发挥其止血功能，进而产生不同的输注疗效。根据HPA-2基因型，可得到HPA-2b的等位基因频率。HPA-2多态性在不同研究人群中的等位基因频率存在很大差异。HPA-2多态性2b等位基因携带者在高加索白人中的频率约为19%~23%，在亚洲人中为0~6%[8]。本研究人群中，HPA-2b纯合子只有1例，HPA-2b等位基因频率为13/198（6.5%）,与既往研究在亚洲人中分布的结果一致。该研究表明，血小板糖蛋白HPA-2基因型频率在A型和B型血小板捐献者中的分布无显著差异。参考文献：[1]GeorgeJN.Platelets.Lancet2000;355:1531-1539.[2]FrancoRF.Genepolymorphismofthehaemostaticsystemandtheriskofarterialthromboticdisease[J].BrJHaematol,2001,115:491-506.[3]SonodaA,MurataM,ItoD,etal.AssociationbetweenplateletglycoproteinIbalphagenotypeandischemiccrebrovasculardisease.Stroke,2000,31(2):493~497.[4]张涌，王荫华。血小板糖蛋白HPA-1和HPA-2基因多态性与脑血栓形成的相关性研究。中国神经免疫学和神经病学杂志，2006；13（3）：140-143.[5]OzeloMC,CostaDS,SiqueiraLH,etal.GeneticvariabilityofplateletglycoproteinIbalphagene.AmJHematol,2004,77(2):107~116.[6]UlrichtsH,VannoorelbekeK,CauwenberghsS,etal.vonWillebrandfactor:butnotalpha-thrombinbindingtoplateletglycoproteinIbalphaisinfluencedbytheHPA-2polymorphism.ArteriosclerThrombVaseBiol,2003,23(7):1302~1307.[7]黄慧，冯明亮等。人类血小板同种抗原研究进展。中国实验血液学杂志，2006；14（6）：1262-1268。6[8]ChenCH,LoYK,KeD,etal,PlateletglycoproteinIaC807T,IbC3550TandⅢaPlA1/A2polymorphismsandischemicstrokeinyoungTaiwanese[J].JNeurolSci,2004,227:1~5.作者简介：安涛男，山东济南人，硕士，主管检验师。联系电话：1386410802680965133（办公）e-mail：[e-mail]汪运山，通讯作者，男，山东省人，教授，硕士生导师，主要研究领域：临床免疫学、分子生物学。通讯地址：山东省济南市中心医院医学检验中心。联系电话：[phone]。