有机小分子探针

有机小分子探针黄美英2014010714摘要细胞内生物活性化合物在细胞内作用靶点的确定是化学生物学和药物开发中的关键问题之一。作为功能蛋白质组学中的一项重要技术,小分子探针在确定生物活性化合物细胞内作用靶点的研究中扮演着举足轻重的角色。PH值在生理及病理过程如受体介导的信号传导、酶活性、细胞生长和凋亡、离子运输和稳态调节、钙含量调节、细胞内吞作用、趋化作用、细胞粘附和肿瘤生长等过程中起到非常重要的作用。本文介绍了几种小分子探针原理，技术和方法，并通过列举近年来该技术应用的成功示例进一步阐明小分子生物活性探针技术的应用原理和重要性。关键词生物活性化合物；小分子探针；PH值；DNA探针技术一绪论荧光探针是化学传感技术领域在上个世纪八十年代的一项重大发现，目前己有愈来愈多的荧光探针应用于分子水平上进行实时检测。荧光检测技术由于灵敏度高，操作简便，可视性强，且对细胞、生物体的损伤小，成为了用于临床分析、环境监测、生物分析及生命科学等领域不可缺少的检测工具[1]。分子荧光探针的检测对象包括各种离子、小分子、自由基、多肽、酶，甚至还包括温度、极性、粘度等。人们可以使用荧光显微镜、荧光光谱仪、流式细胞仪、荧光活体成像系统等仪器获取荧光探针检测的相关信息，借助荧光成像技术我们能够实时检测活细胞内分子或离子的浓度以及生物大分子结构的变化过程，也可以获得关于生物组织生理代谢过程的相关信息，还可以实现生物活体的荧光成像[2]。另一方面研究者们能够根据需要设计合成出满足“特定要求”的探针分子，基于此，荧光探针和荧光检测技术在生命科学的发展中起到举足轻重的作用[3]。通常一个光探针分子由荧光团（Fluorophore）和识别基团（Receptor）通过连接臂（Spacer）以共价键方式连接，荧光团作为信号转换器将识别行为转化为光信号，可以通过荧光的增强或淬灭乃至光谱位移的变化对分析物进行识别。荧光探针分子具有非常大的可塑性和应用潜力，通过对有机分子结构进行巧妙设计和改造，就能够设计合成出满足各种需要的荧光探针。按照光化学反应原理，荧光传感器主要可以分为以下几类：光诱导电子转移(photoinducedelectrontransfer，PET)，分子内电荷转移(internalchargetransfer,ICT)，扭转分子内共轭电荷转移（twistedintramolecularchargetransfer,TICT），分子内单体-激基缔合物(monomer/excimer)，金属-配合体电荷转移(metal-to-ligandchargetransfer,MLCT)，光诱导荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)，激发态分子内质子转移(excitedstateintramolecularprotontransfer,ESIPT)，聚集诱导发光（aggregation-inducedemission,AIE），C=N异构化（C=Nisomerization）。荧光探针因其具有体积小、成本低、无需预处理、不受外界电磁场影响等优良特性可以广泛应用于临床分析、环境监测、生物分析及生命科学等领域，成为当前一个重要的研究热点。寻找灵敏度高、选择性好、对光稳定、高量子产率、具有新的传感机理、具有长波发射、优良水溶性以及生物相容性等特性的分子探针，对于光化学传感器的研制是非常必要的。氢离子是自然界中分布最广泛的阳离子，化学反应的进行或完成，细胞和细胞器的许多重要生理过程都与pH值密切相关。人体细胞内pH值在细胞、酶和组织的许多重要生理及病理过程中起着关键性的作用，例如，细胞的增殖和凋亡、细胞内吞作用、离子运输和动态平衡、多药抗药性、肌肉收缩等。pH异常会引起细胞功能紊乱，还会导致癌症、阿尔海默病等疾病。pH的变化还会通过间隙连接和信号通路的变影响到突触传递、神经元兴奋性和细胞间耦合等神经系统活动[4]。细胞中的pH可划分为两个范围，即酸性细胞器(内涵体、溶酶体)的pH范围4.5~6.0，细胞质6.8~7.4[5]。癌细胞活性在pH值6.85~6.95时最强，而且也必须在酸性条件下，才能进行转移，所以酸性体质是产生癌症的主要原因，同时它会使人体免疫细胞的功能下降而不足以对抗癌细胞。因此，pH的检测对生物学和医学研究具有重要意义。一些有机化合物随pH值变化时的吸收和发射性能可用来指示被测体系中酸碱性的改变，这种基于光学信号变化而建立的pH值测定方法可弥补传统玻璃电极所存在的电化学干扰和机械损伤等缺陷。荧光探针是建立在分子识别和荧光技术两者有机结合的基础上，通过特定的受体结合目标，实现分子的识别，并随之通过相应的荧光信号传导机制将这种分子结合信息转换为易于检测的荧光信号，从而实现在单分子水平上的原位实时检测方法[6]。荧光法测定pH值具有高灵敏度、高选择性、操作简单、响应快速、高信噪比以及大多数情况下对细胞无损伤等特点[7]。利用各种荧光参（如发射波长、荧光强度、荧光寿命等）的变化来精确测量细胞内pH值，不仅便于荧光显微学研究，而且可实时检测细胞内外pH值的动态分布和区域变化，进一步与显微荧光成像、近场光学技术等结合，对原位检测生命体内的微小体系中的氢离子浓度及其变化非常有效，能够为研究小至单个细胞器的生理学和病理学过程提供关键信息，对于理解细胞内许多生理功能的规则机制有着重要的作用[8]。另外，氢离子荧光探针对环境监测和工农业生产等领域的pH值监控也很有意义。汞是一种易挥发的元素,可以在大气层以及土壤、海洋等中聚集,汞元素/汞离子一旦进海洋,细菌可将无机汞转化为有机汞(如甲基汞),并不断的在海洋中的生物体内累积,尤其是可食用的鱼类体内累积,最后经食物链被人类吸收[9]。甲基汞会毒害神经,可导致感知、行为紊乱和神经损伤,对机体造成以神经毒性和肾脏毒性为主的多系统损害从而对人类健康构成巨大威胁[10]。当前,常见的汞元素检测手段主要是原子吸收/发射光谱法、X射线荧光光谱法、电感耦合等离子体-质谱、核磁共振、比色法(如传统的双硫腙法)、电化学方法(如阳极溶出伏安法、氧化还原电位法等)。但这些分析手段在实际应用中既昂贵又繁琐,且常常需要特殊的实验仪器。因此,高效、廉价、简捷的汞检测手段成为重要的研究课题。在各种离子/分子的检测方法中,荧光探针检测法由于具有便捷性好,选择性、灵敏度高,无需参比,不受电磁场的影响,易于通过光纤实现对化学和生命体系中的分析对象进行远程、实时、在线自动监测而极为引人注目[11]。近年来汞离子荧光探针正是在上述背景下产生的。荧光探针是超分子科学中最为引人入胜的领域之一,它的基本设计思路是在荧光染料母体(荧光团)上引入受体单元(识别基团),金属离子与受体单元相结合或发生化学反应,并最终影响荧光团的光物理性质,通过荧光的变化如荧光强度的变化、荧光光谱的移动、荧光寿命的变化尤其是荧光强度的变化,直观地体现金属离子的存在。基于各种光物理和光化学过程[12-16]如光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移(ICTorMCT)、激发态分子内质子转移(ESIPT)、荧光共振能量转移(FRET)、激基缔合物(MonomerorExcimer)的形成和消失等,荧光探针能将这种分子结合信息转换成易检测的荧光信号,而且可在单分子水平上实现原位、实时检测。荧光分子探针的主要应用领域是生物、医学和环境监测,所以在水溶液中的识别才具有潜在的广泛应用价值。另外,许多探针分子的荧光性质会受质子的影响,在水溶液中可以通过缓冲液控制稳定的pH值,使识别研究的结果更可靠。由于水分子对金属离子较强的水合作用以及水分子对探针分子识别基团较强的结合,使水溶液中的金属离子识别比有机溶剂中的具有更大的难度。DNA在生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动及突变、癌变等异常生命活动中起着非常重要的作用。定量测定是研究的基础,分子的定量分析、特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。的定量测定是研究的基础,发展灵敏度较高的检测方法变得尤为重要。测定的方法中以分子光谱法居多,目前常用的有紫外可见分光光度法、荧光光度法以及共振瑞利散射法等。荧光光谱法具有选择性好和灵敏度高等优点,由于核酸的内源荧光很弱,因而不能利用荧光技术直接测定核酸的结构和性质,所以采用荧光法研究和测定核酸时,必须引入荧光探针。利用核酸对小分子荧光探针的荧光变化来研究小分子和的相互作用或进行核酸的定量分析,方法简单且应用较广。同时,许多分子能与发生相互作用,研究小分子与的作用机理,一方面,靶向化合物成为很重要的核酸探针选择对象;另一方面临床上使用的许多抗癌药物都以为作用靶点,通过与癌细胞发生相互作用破坏其结构,进而影响基因调控与表达功能,表现出抗癌活性;一些致癌物也能与形成加合物,这种加合物也是可能癌变的预警标志物,小分子与的相互作用的研究不仅有利于探索和开发新的核酸探针,而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理,阐明有毒物的致癌、致畸的分子生物学机理,为临床上设计更为有效的抗癌药物提供理论指导。过渡金属络合物荧光探针过渡金属离子为钌(Ⅱ)、铹(Ⅲ)、锇(Ⅱ)、铂(Ⅱ)、锰(Ⅱ)、锌(Ⅱ)、铜(Ⅰ)、铁(Ⅱ)、钴(Ⅲ)以及钒(Ⅱ),它们易与具有π空轨道的配位体形成含有反馈键的络合物,即中心离子与配位体之间的电子相互转移而形成π键的络合物,可以作为核酸荧光探针。桑色素也可以和过渡金属组成配合物作为荧光探针来测定核酸。一些贵金属络离子可作为探针。核酸分子“光开关”是指其水溶液在室温条件下无荧光现象,当加入双链后产生很强荧光的类钌络合物。通过嵌入方式键合到或的过渡金属络合物,也称为金属嵌入剂。DNA与探针分子或离子的作用方式许多小分子能与发生相互作用,通过各种模式的作用机理影响到基因的调控和表达,因此研究有机小分子与的相互作用很有实际意义,小分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环部分。分子中平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架和两条核苷酸链螺旋形成的大沟和小沟构成了有机小分子与相互结合的位点作用的方式主要有共价结合、剪切作用、长距组装及非共价结合等四种类型另外还有氢键、范德华力、疏水作用等弱相互作用。绝大多数的有机小分子与的作用形式为非共价结合它又包括静电作用、嵌入结合和沟面结合而且通常不是一种力的单独作用而是多种作用力的协同作用。近期研究表明小分子与相互作用形式还有“半嵌插结合”由于超分子化学的发展,分子与核酸还涉及到长距组装。小分子与的相互作用的研究不仅有利于探索和开发新的核酸探针,而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理,阐明有毒物的致癌、致畸的分子生物学机理,为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导。参考文献[1]Zhang,J.F.;Zhou,Y.;Yoon,J.;Kim,J.S.Chem.Soc.Rev.2011,40,3416.[2]Feng,Y.;Cheng,J.;Zhou,L.;Zhou,X.;Xiang,H.Analyst2012,137,4885.[3]Chen,X.;Tian,X.;Shin,I.;Yoon,J.Chem.Soc.Rev.2011,4783.[4]Lakadamyali,M.;Rust,M.J.;Babcock,H.P.;Zhuang,X.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2003,100,9280.[5]Cardone,R.A.;Casavola,V.;Reshkin,S.J.Nat.Rev.Cancer2005,5,786.[6]Callan,J.F.;deSilva,A.P.;Magri,D.C.Tetrahedron2005,61,8551.[7]Han,J.;Burgess,K.Chem.Rev.2010,110,2709.[8]Wang,R.;Yu,C.;Yu,F.;Chen,L.Trac-Trend.Anal.Chem.2010,29,1004.[9]HarrisHH,PickeringIJ,GeorgeGN.TheChemicalFormofMercury