有机试剂5,荧光试剂.

第五章荧光试剂•荧光的发现及发展•荧光产生的理论基础•分子荧光光谱•荧光强度、荧光量子产率和荧光寿命•有机试剂结构与荧光的关系•代表性荧光试剂荧光的发现及发展•十六世纪被发现，但对荧光的产生原理和条件•1852年Stokes考察奎宁和叶绿素荧光发现荧光波长比照射光波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，，提出了“荧光”•1867Goppetsroder桑色素荧光检测铝•二十世纪初，已荧光素、稠环芳烃及曙红等600余种化合物有荧光•1924年Wawwillous测定荧光产率•1926年Gavila对荧光寿命进行了测定荧光产生的理论基础•基态和激发态•单重态（S)和三重态(T)TTSSSFPisciscicicic21102E荧光激发光谱和荧光发射光谱•λemλex斯托克斯（stokes）位移荧光强度、荧光量子产率和荧光寿命•荧光强度F=2.3ФFIoεbcF—荧光强度；ФF—荧光量子产率，Io—照射到被测物质上的光强度；ε—该物质的摩尔吸光系数；b—检测池厚度；c—物质浓度荧光量子产率荧光量子产率与荧光强度的区别•荧光量子产率是荧光物质的固有属性•其与物质浓度无关•荧光强度与物质浓度有密切关系•同浓度下，荧光量子产率高的荧光越强（排出外界条件影响）荧光寿命•荧光寿命（τ）•lnFo-lnFτ=-t/τFo和Fτ分别代表t=0和t=τ时的荧光强度，通过实验测量不同时间的Ft值，确定lnFt—t的关系曲线，应为直线•直线斜率就是荧光寿命•用式子τ=10-5/εmax估计荧光寿命，εmax为最大吸收波长下的摩尔吸光系数，如S0-S1跃迁的ε值一般为103，估计荧光寿命是10-8s.影响有机化合物荧光的有机试剂结构因素•分子共轭体系•共轭大π键共平面程度及其刚性•.取代基影响•杂原子影响•分子离子化对荧光的影响•立体结构分子共轭体系大小对荧光的影响•有机荧光团能发射出荧光的共軛π键的基团•（-CH=CH-）n（n2），苯，萘，对苯二醌，苯并杂环、吡喃酮以及占吨酮基团•共轭体系越大，荧光量子强度越高•对于稠环芳烃，具有相同芳香环数的化合物，芳环的连接和排列顺序不同，化合物的有关荧光性能也不同•芳环直线性排列的化合物的荧光发射波长比非线性排列的波长要长•芳香环数越多，共轭体系越大，荧光越强•芳香环或共轭体系增加到一定程度，只是荧光发射波长向长波红移，ФF不再增加，还可能降低共轭大π键共平面及其刚性的影响•有机分子具有共軛平面结构才显示出荧光特性•分子的共轭体系必须具备共平面性•共軛体系的平面结构还要有一定程度的刚性C252(CH)NN(CH)252+CCOOHON(CH)252+252(CH)N取代基的影响•取代基种类的影响取代基有推电子取代基和吸电子取代基•推电子取代基：-NH2、-NHR、-NR2、-OH、-OR（R=-CH3、-C2H5等•吸电子取代基：C=O、-NO2，-COOH，-CHO、-COR（R=-CH3，-C2H5等）、-N=N-、卤素（-F，Cl，Br，I）等•推电子取代基增强荧光推电子取代基增强荧光•取代基中O或N上的孤对电子参与有机荧光分子的共轭大π键，扩大共轭体系•波长红移，荧光强度明显增加•极性溶剂中易形成氢键，强酸中易质子化，碱性介质中可离解出H•质子化试剂分子带正电，使荧光减弱•离解出H试剂分子带负电荷，荧光增强吸电子取代基减弱荧光•类取代基中的n电子跃迁到π*属于禁阻跃迁，激发态分子数较少•S1－T1的体系间跨越占优势，激发态分子放出光子的数大为减少，使荧光减弱•－CN氰基（-C≡N）是不饱和取代基，它应使取代的化合物荧光减弱，但实际结果是表现出推电子的效果—荧光增强•－F虽是吸电子取代基，但增强荧光•磺酸基含有不饱和键，表现出吸电子性能，应减弱荧光•但它易离解出H带负电荷，又体现出推电子的行为，使荧光增加•增减相低，磺酸根的引入一般无显著荧光变化，最明显的是试剂水溶性的增加取代基数量及其所处位置的影响•对于不同的发光母体，同类取代基所处位置不同所表达的荧光强弱变化规律也不相同•小体积取代基所贡献的共轭效应小只是体现出其电荷影响•大的取代基如苯或乙炔基苯，其共轭效应大，取代后扩大共轭体系，荧光增强的效应大于其吸电子使荧光减弱的效应结果是取代后的荧光强度不是减弱而是大大增强两类取代基共同作用•推电子基和吸电子基共存时，推电子基结合在对于吸电子基共振电子密度减小的原子上，构成荧光性•7-羟基香豆素（ФF=0.37）•6-和8-羟基取代香豆素无荧光•4-甲基-7-羟基香豆素则因甲基的超共轭效应使荧光增强（ФF=0.41）OO12345678•两个以上推电子基同时取代，化合物的荧光会受到抑制如甲氧基苯的ФF是0.291，4-二甲氧基苯的ФF是0.21，再如甲苯的ФF是0.17对甲酚的ФF等于0.09，（取代基）加重效应对荧光的影响•加重效应减弱荧光ONONCH3NNCH3CH3NONCH3NNCH3CH3SФF是0.22，ФP（磷光量子产率）是0.14ФF等于10-5，ФP变为0.43芳香环中杂原子的影响•增强或减弱荧光，看杂原子化合物结构•吡咯、噻吩及呋喃荧光量子产率很小，苯并后的吲哚、硫茚及苯并呋喃荧光大大增强•n——π*跃迁变为π——π*跃迁问题：从分子结构和光谱特性讨论有机显色剂和荧光试剂的联系与区别。ONNHФF0.86ФF约1.0ФF0.90.分子离子化对荧光的影响•分子离子化对荧光影响很大*荧光试剂在不同酸度下离子化产物的荧光强度大小不同*选择适宜条件，使试剂有最大荧光强度，以便于高灵敏检测分子的立体结构也影响荧光•1，2-二苯乙烯反式具有较强的荧光，顺式则无荧光CHCHCHCH无机离子的主要有机荧光试剂•钙黄绿素类似物22(CHCOOH)OHOOCOOH22(CHCOOH)CH2NCH2N(CHCOOK)22(CHCOOK)22ONONOCH2COONCH3CH2OKOHOClClONOCH2CH3NCH2O22(CHCOOH)22(CHCOOH)(CHCOOK)22(CHCOOK)22NOCH2NHCOOCH3NCH2OCH3ONCH2OCH3NN(CHCOOK)22(CHCOOK)22NOCH2OCH3NCH2O22(CHCOOH)22(CHCOOH)N(CH)32(HC)N32+Cl-(CHCOOK)22(CHCOOK)22+SO2NHNNNONCH2OOCH2(CHCOOK)22(CHCOOK)22OCH2NNHCOOOHClClOCOOCOOOOHOCONHNCH2OClClKK2，2-ˊ二羟基偶氮苯同系物HONNHOOHYR西夫碱和腙类OHNHOXYCHNRZNCHHOCHNNHCSNH2.2-羟基-1-萘甲醛缩氨基硫脲0.03-0.7μgGa/ml，λex/λem=412nm/470nmOHCHNNHNN3-羟基皮考啉醛缩-2-吡啶腙（38）在pH4.7荧光测定Al3+，检测限小于2ng苄基-2-吡啶酮-2-喹啉腙（37）可以荧光测定10ng的锌CNNHNCH2N8-羟基喹啉（HQ）和8-羟基喹啉-5-磺酸（HQSβ-二酮类黄酮类蒽醌类OOABCDEFGI三苯甲烷占吨酮类•酸性化合物1.荧光素同系物曙红和二溴荧光素2.苯芴酮同系物•碱性化合物罗丹明6G丁级罗丹明B罗丹明4G罗丹明3B罗丹明B还有卟啉某些无机阴离子和小分子的荧光试剂•测定亚硝酸根•2，3-二氨基萘•1，2-二氨基-5，7-萘二磺酸NH2NH2SO3HHO3Sλex/λem=298nm/429nm，不需萃取，检测限达到0.09ng/ml2，3-二氨基萘与Se（IV）形成硒唑测硒，λex/λem=366nm/520、560nm，测定范围0.4-6.0ng/mlHOOHOOONH2H2NHOOHOOONHNNNO+O22CONH-NHONH2N(CH)252(CH)N522+CONH-NHNOONH2N(CH)252(CH)N522+NO(NO)2-与NO形成荧光素三氮唑检测生物体内的NO，检测限为5nmol/L检测限1μmol/LCHONNNH2NONCOHOOH+H+2-苯乙酰-1，3-茚满二酮-1-腙（2-DBIH）测定溴氧（O3）的荧光试剂，基于在三氯甲烷中溴氧与1，2-二-（4-吡啶基）乙烯反应生成4-甲酰基吡啶，4-甲酰基吡啶与2-DBIH反应生成荧光产物，λex/λem=468nm/536nm，检测限0.02μg*在过氧化酶的存在下，过氧化氢（H2O2）氧化7-羟基-6-甲氧基香豆素（莨菪亭，58）并使其荧光下降，据此可以测定H2O2，检测限10-10mol[118].还原剂会影响这一反应的进行*在微碱性（pH7.2）溶液中，有过氧化酶存在，H2O2会氧化二乙酰二氯二氢荧光素为强荧光的化合物，用于测定2×10-11-3×10-10mol/ml[*荧光素-乙酸汞在碱性溶液中具有荧光，λex/λem=499nm/520nm，加入S2-后，荧光减弱，可测定微量硫*四氯荧光素汞化合物也用于测定硫化物测定某些有机物、药物等的荧光试剂•蒽酮测定丙三醇λex/λem488nm/575nm，测定10-75μg•丙三醇在浓H2SO4中脱水成丙烯醛OOCHCHCH2CH2CHCHOO+HSO24+O2+HO2OHCHNNCHHO水杨醛与肼反应生成的席夫碱水杨醛缩连氮，测定肼CCCCHOCHHOCH2OHOHOOHCCCCHOCHHOCH2OOOOHNNOOCHOHCH2OHNH2NH2-2H脱氢抗坏血酸与邻苯二胺反应生成具有蓝色荧光的化合物，λex/λem=350nm/430nm，可测定0.3pmol-10nmol/L的抗坏血酸甲醛、乙酰丙酮和氨缩合反应生成具有荧光的3，5’-二乙酰基-1，4-二氢-2，6-二甲基吡啶，λex/λem=412nm/510nm，可测定0.005-0.97/ml的甲醛NHCH3CH3COCH3COCH3CH3CCHCOHCH3OCH3CCHOCCH3HOCHHONHHH这一荧光反应产物还可以测定甘油三酯—血脂，甘油三酯用氢氧化钾皂化得到甘油CH2CHCH2OHOHOH+2HIO42HCHO+HCOOH+2HIO+HO32