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植物基因组DNA的提取纯化及鉴定1.1、植物基因组DNA提取要略–基因组DNA：指一个细胞中遗传物质的总量。真核细胞常为二倍体，所以其基因组是指细胞中的单套染色体及其上的基因。–植物基因工程操作离不开植物基因组DNA的制备，与微生物和动物材料相比，从植物中提取DNA常碰到以下突出问题：1、植物的细胞壁不容易用一般的生化试剂破坏，需用机械方法，这样由于产生剪切力不利于提出高分子量的DNA。为降低研磨时的剪切力及提高研磨的效率，现常采用将植物材料经液氮速冻后再研磨成细粉的方法。植物基因组DNA的提取纯化及鉴定2、植物细胞常含有较多的多糖，很容易污染DNA，降低DNA的纯度，这些多糖还能抑制限制酶、连接酶及聚合酶等分子生物学酶类的活性。现常采用氯化铯密度梯度离心的方法来除去多糖。3、植物材料中，特别是老的或经逆境处理的材料，常含有大量的酚类化合物，这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合，使DNA带棕色或褐色，并能抑制DNA的酶解反应。常通过在抽提缓冲液中加入2~5%的巯基乙醇，来防止这类情况的出现。植物基因组DNA的提取纯化及鉴定–关于植物基因组的提取方法，常用的有两种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法和十二烷基磺酸钠（SDS）法。–传统的CTAB提取法步骤多，较繁琐，时间长，产率低，虽然可很好地除去多糖类杂质，但酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。–SDS法则操作相对简单，条件温和，也可提取到较高分子量的DNA，但所得的产物含糖类杂质较多，对酶切也有影响。本试验不进行酶切，采用SDS法提取植物基因组DNA。1.2、植物基因组DNA的提取纯化原理植物基因组DNA的提取纯化及鉴定0植物幼嫩叶片研磨SDS破细胞氯仿使DNA与蛋白质解离离心沉淀：细胞碎片、变性蛋白等上清：DNA、RNA、蛋白质、糖等酚离心下层：酚中层：变性蛋白上清：DNA、RNA等酚/氯仿离心RNase37℃保温15min除RNA乙醇离心下层：酚、氯仿中层：变性蛋白上清：DNA、RNA等上清：核苷酸等沉淀：DNA植物基因组DNA的提取纯化及鉴定1.3、紫外吸收法测定核酸的原理–核酸分子由于含有具共轭双键结构的嘌呤和嘧啶碱基，可强烈吸收250~280nm波长的紫外光，其最大吸收波长为260nm，最小吸收波长为230nm。常可据此对核酸进行定量的测定和纯度的鉴定。1、定量测定–定量测定时可将OD260代入下列经验公式粗略计算核酸的浓度：DNA浓度（ug/ml）=OD260×N0.020×L植物基因组DNA的提取纯化及鉴定–0.020：每毫升溶液内含1ugDNA的OD260值。–0.024：每毫升溶液内含1ugRNA的OD260值。–L：比色杯的厚度，常为1cm。–N：稀释倍数。2、纯度鉴定–如OD260/OD280＞2，说明RNA没有除干净或DNA已变性解链。RNA浓度（ug/ml）=OD260×N0.024×LOD260OD280OD260OD2301.8≤≤1.9≥2.0纯DNA：植物基因组DNA的提取纯化及鉴定–如OD260/OD280＜1.7，说明蛋白质没有除干净。–如OD260/OD230＜2，说明小分子物质（如酚，盐酸胍等）没有除干净。–紫外吸收法简便，灵敏度高，不消耗样品。对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。但若样品中混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，则应设法事先除去。OD260OD280OD260OD230≥2≥2.0纯RNA：植物基因组DNA的提取纯化及鉴定1.4、二苯胺显色法测定DNA含量的原理–DNA在酸性条件中加热，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶寡核苷酸。脱氧核糖在酸性条件下通过脱水可转变为ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺在酸性环境中生成蓝色物质，该蓝色物质在595nm波长处有特征光吸收，OD595与脱氧核糖（即核酸）的含量成正比，可据此对核酸进行定量测定。植物基因组DNA的提取纯化及鉴定–用二苯胺法测定DNA含量时灵敏度不高，待测样品中含量若低于50ug/ml就难以测定（测定范围40~400ug）。若在反应液中加入少量乙醛，则可显著提高检测的灵敏度。样品中含有少量RNA时不影响测定，但蛋白质、多种糖及其衍生物、芳香醛、羟基醛等由于能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。核酸嘌呤碱+脱氧核糖+脱氧嘧啶寡核苷酸H+脱氧核糖ω-羟基-γ-酮基戊醛蓝色物质二苯胺H+595nm处具特征光吸收，OD595值与脱氧核糖含量成正比，可据此进行比色测定。植物基因组DNA的提取纯化及鉴定1.5、核酸的琼脂糖凝胶电泳法检测核酸的纯度和分子量的原理–核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。–电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。植物基因组DNA的提取纯化及鉴定–不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp~50kb的DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。–当用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA样品时，根据条带的多少和条带的位置即可知道DNA样品的纯度。–此外,通过电泳还可了解DNA样品中的杂质，如RNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分子量。（DNA在凝胶中的电泳迁移率与其分子量的对数成反比。）