朊病毒的致病机理及其检测

食品微生物学进展课程论文题目：朊病毒的致病机理及其检测姓名：费鹏学号2011309110056专业：粮食、油脂和植物蛋白工程指导教师：陈福生职称教授中国·武汉二○一二年一月食品微生物学进展课程论文1朊病毒的致病机理及其检测摘要：朊病毒病是人和动物的一种致死性的神经系统退行性疾病，主要包括羊骚痒病，疯牛病，以及人的克—雅氏综合症。其致病因子被认为是一种由正常细胞PrP蛋白经非正常折叠所形成的蛋白质（PrPsc）。本文对其理化性状、致病机理以及检测方法加以综述。关键词：朊病毒；羊骚痒病；疯牛病；克—雅氏综合症；致病机理；Abstract：Priondiseasesisafamilyoffatalneurodegenerativedisordersinbothhuma-nsandanimals,includingscrapieinsheep,BovineSpongiformEncephalopathy(BSE)incattleandCreutzfeld-JakobDisease(CJD)inhuman.Thepathogenicfactorofthesediseasesisthoughttobeaabnormalisoformprotein(PrPSc)ofanormalcellularprotei-n-PrPC.Inthisreviewthepresentknowledgeconcerningthephysico-chemicalfeatur-esofprion,prionpathogenesisaswellasdetectionmethodispresented.Keywords:prion;scrapie;BSE;CJD;pathogenesis;朊病毒,也称为朊粒，是一种只有蛋白质而没有核酸的传染因子。它是动物和人传染性海绵状脑病（TransmissibleSpongiformEncephloathy,TSE）的主要致病因子。1982年Prusiner提出“唯蛋白”假说，以后Weismann等人对其逐步完善，并成为目前的主流学说。该假说认为：TSE是哺乳动物细胞中普遍存在的正常细胞PrP(CellularIsoformofPrionProtein，PrPC)转变为致病性的异常痒病型PrP(ScrapieIsoformOfPrionProtein,PrPSc)所致。PrPSc在感染动物脑内形成不溶性的、抗蛋白酶的积聚物而引起动物发病，1985年英国爆发疯牛病后，朊病毒引起了人们的极大关注。而且随着时间的推移和科研水平的提高，朊病毒蛋白的结构特征、生化特性及致病机理的研究取得了显著进展(刁小龙，2007）。由朊病毒引起的传染性海绵状脑病有在动物中有羊瘙痒病(scrapieofsheepandgoat)、水貂传染性脑病(TransmissibleMinkEncephalopathy，TME)、鹿慢性退行性变(ChronicWastingDiseaseofDeer，CWD)、牛海绵状脑病(BovineSpongiformEncephalopathy，BSE)以及猫海绵状脑病(FelineSpongiformEncephalopathy，FSE)等。在人类中的疾病主要有库鲁病(Kurudisease)、克-雅病(Creutzfeld-JakobDisease，CJD)、格斯特曼综合征(Gretmann-StrausslerSyndrome，GSS)、致死性家庭失眠症(FatalFamilialInsomnia，FFI)、克-雅病变种(variantCJD，v-CJD)（侯佩强，2003）。食品微生物学进展课程论文2一、朊病毒的发现及其特性1朊病毒的发现早在200多年以前,英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病，即羊瘙痒病，但病因并不清楚（杨正，2011）。随着技术的发展，这种病越来越被人们所注意。这种为了探究这种致病原的性质，研究人员检测了羊瘙痒病病脑匀浆对动物的致病能力。发现感染因子可以通过滤器，有点象病毒，但与病毒不同，用福尔马林处理不能使之完全失活。1966年，英国放射生物学家Alper发现，这种物质对254nm的紫外线照射不敏感，而对237nm的紫外线敏感。1972年，由于Prusiner的一位病人死于克雅氏病，促使他开始研究这类疾病。经过10年努力，Prusiner与其同事终于在1982年从仓鼠脑中浓缩了羊搔痒病病原成分。这是一种直径25nm长约100～200nm其浓缩成分的活性可被蛋白酶K，二乙酰焦碳酸、尿素、酚和SDS等破坏，但不能被核酸酶E或紫外线照射破坏。所以Prusiner称之为Prion,意为蛋白性感染颗粒（Proteinaceousinfectiousparticle）。这个成份中只含一种蛋白质，称为朊病毒蛋白（prionprotein，PrP），并命名为朊病毒（Virino）。Prusiner因此获1997年诺贝尔医学和生理学奖。2PrPC与PrPSc与细菌、真菌及病毒等病原体不同，prion是一种不含核酸的蛋白质，普遍存在于人和动物细胞内并由宿主自身基因编码。正常的细胞型构象PrPC没有致病性,但在一定的条件下可以转化成瘙痒型PrPSc这种异常构象，从而引起传染性海绵状脑病的发生。PrPC和PrPSc虽然具有完全相同的一级序列，但因构象上的差异导致生化性质显著不同：PrPC是可溶的单体，以α螺旋为主，易被蛋白水解酶K降解；PrPSc高度不溶，β折叠含量高，极易形成抗蛋白酶K水解的多聚体（林东海，2011）。PrP的构象变化造成了其理化和生化性质的显著变化。3PrPSc理化性质及生化特性3.1PrPSc独特的理化性质⑴高压蒸汽灭菌（134℃～138℃）18分钟不能使其完全灭活。⑵对紫外线（波长254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高40～200倍，但是对237nm的紫外线敏感（白丽荣，1999）。食品微生物学进展课程论文3⑶对一般的离子辐射和超声波抵抗力很强。⑷对许多微生物有致死作用的一般化学消毒剂对朊病毒却无法起到坡坏作用，如37℃的20%的福尔马林溶液中可存活28个月。⑸对多种核酸酶（RNA酶和DNA酶）有抵抗作用，但可以被胰蛋白酶降解。这一点也证明了朊蛋白中不含有核酸。⑹一些蛋白质变性剂或氨基酸化学修饰剂对其具有灭活或抑制作用，如尿素、SDS等处理则使其失去活性。3.2PrPSc独特的生化特性⑴不形成包涵体，不含非宿主蛋白，不诱生干扰素，对干扰素也不敏感，不干扰其他病毒诱生干扰素，也不受普通病毒干扰。⑵不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能，也不引起宿主的免疫反应。⑶在电镜下见不到其病原颗粒，但可检测出痒病相关纤维（SceapreAssociateFibrils，SAF）⑷朊蛋白病毒一旦致病，免疫增强剂和免疫抑制剂均不能改变致病过程。⑸朊蛋白病毒（PrPSc）在温和的清洁提取物中大量聚合成痒病相关纤维（SAF）或短杆结构，即在非变性去污剂中不溶，而细胞朊蛋白（PrPC）则可以完全溶于其中，只以单体或是二聚体形式存在，故用核磁共振（NMR）和X光谱分析就可以检测到PrPC的三维构象，却不能辨别PrPSc的构象。⑹PrPSc具有相对的抗蛋白酶水解特性，如在用蛋白酶K进行水解时，PrPSc只被水解掉其N-端的67个氨基酸残基，形成PrP27～30，成为其致病的“无敌先锋”。而PrPC则可被完全水解掉，故PrPSc的半衰期特别长，而PrPC的半衰期短（杨建民，2004）。⑺PrPSc和PrPC都依赖于磷酸肌醇磷脂酶结合位点（GPI）附着在细胞表面，经过磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，PrPSc不能从膜上释放，而PrPC则可以。用TrionX-114进行相分离后，PrPC处于水相。而PrPSc则处于TrionX-114相中。⑻用特异的抗体与朊蛋白反应，PrPSc有血清反应，而PrPC则没有反应。说明两者的高级结构是不同的。食品微生物学进展课程论文4二、PrPSc的致病机理和转化1阮病毒的致病机理关于朊病毒的致病机理，主要有两种观点。一个是由于PrPC正常功能的缺失，另一个是由于PrPSc的过度增殖而产生神经毒性。除此之外，还有拟病毒假说与联合假说等等。1.1PrPC正常功能的缺失PrPC的编码基因在小鼠中位于2号染色体,在人类位于20号染色体。PrPC在神经元、神经胶质细胞、小胶质细胞、肌细胞、白细胞等多种细胞中表达。关于PrPC生理功能的研究进展较为缓慢，目前发现其可能在神经系统、T细胞信号转导及核酸代谢等方面发挥一定作用（王小凡，2005）。1.2PrPSc的神经毒性PrPSc具有潜在的神经毒性，其中PrP106-126称为神经肽，单独这一段小肽也能使在体外培养的神经细胞发生凋亡。而大量PrPSc在CNS尤其是在脑内的积累可抑制Cu2+与SOD或其它酶的结合，从而使神经细胞的抗氧化作用下降，PrPSc还可抑制星形细胞摄入能诱导其增殖的Glu。此外，细胞内的PrPSc可能还抑制tau调节的微管蛋白的聚合,导致L-型钙通道发生改变，进而使细胞骨架失去稳定性，最终都可使神经细胞发生凋亡并形成空泡状结构，进而使各种信号传导发生紊乱。外在表现为自主运动失调、恐惧、生物钟紊乱等症状（乔俊文，2006）。1.3酵母菌朊病毒假说Cox(1965)发现在某些酵母菌株内存在一种引起终止密码抑制的成分，表现为显性，且不遵守孟德尔遗传规律，故命名为[PSI+]。Lacrout发现某些酿酒酵母菌中存在另外一种非孟德尔成分，与[PSI+]具有相似的遗传特性，该成分被命名为[URE3]。Wickner提出用酵母菌朊病毒假说来解释[PSI+]和[URE3]的遗传行为。认为[PSI+]和[URE3]可能和朊病毒一样，是由细胞内正常成分Sup35和Ure2P经构型改变而来，因为蛋白质的C端失去其正常功能，所以能产生Sup35和Ure2P突变相同的表现型；失去正常结构和功能的Sup35和Ure2P又可与新的Sup35和Ure2P相互作用，诱导他们发生同样的构型改变，从而使[PSI+]和[URE3]表现出显性且不遵守孟德尔遗传规律。因此，将[PSI+]和[URE3]称为酵母菌朊病毒(yeastprion)。与哺乳动物朊病毒不同的是：[PSI+]和[URE3]不在细胞间传播，而是由细胞母代传给子代；也不会导致其存在的细胞发生死亡,而是使其产生新食品微生物学进展课程论文5的细胞代谢型。因此,对于哺乳动物和人类，朊病毒是一种致病因子，对于酵母菌，则可视作一类可遗传的代谢表现型决定因子。1.4拟病毒假说Dickinson和Outran首次提出,后由Kimberlin阐述。拟病毒假说即核蛋白论，认为TSEs病原因子是拟病毒,由蛋白质和核酸组成。核酸由宿主酶催化复制,不编码病原因子的蛋白质，但其必需成分与宿主成分(如PrPSc)紧密结合，并受其保护。病原因子蛋白质由宿主基因组编码，并形成核酸的外被，但至今未能证实TSEs病原因子有特异性核酸(Bruce，1997)。1.5联合学说Weissmann认为感染因子是完全朊病毒(holoprion)，它由2种成分组成：一种是分离朊病毒(apoprion)，即PrPSc，由宿主基因组复制，本身就可致病；另一种是协同朊病毒(coprion)，即核酸，它决定毒株的株特异性。这种核酸可能连结于PrPSc上,也存在于正常宿主细胞中。PrPSc单独侵入细胞后，可激活某种细胞核酸,使其呈现协同朊病毒的作用。协同朊病毒借助细胞正常的聚合酶复制，这一过程由PrPSc激发，且可能依赖于PrPSc的存在。这一假说实际上是朊病毒假说和拟病毒假说的综合，使该病原因子的结构理论更趋完善，颇具吸引力,但目前还没有可靠的试验证据(Hornemann，1997)。2PrPSc的形成和蓄积无论PrPSc致病机理是什么，其致病的第一步都是PrPSc的形成过程和蓄积。PrPSc是由PrPC经过构象的转变形成的。关于这一过程目前主要有两种模型来解释：2.1重折叠模型PrPC作为许多动物体的正常代谢的一部分，被不断的合成和降解。但因PrPC结构