木瓜蛋白酶酶活力测定

木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HCL·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。临用现配。4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。5、测定步骤吸取试样溶液1.00ml置于10ml具塞比色管中，于37℃±0.2℃水浴中保温10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00ml，摇匀，置37℃±0.2℃水浴中，反应十分钟，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00ml，摇匀，于37℃±0.2℃水浴中放置40min，用干燥滤纸滤过，取滤液，在2h内在波长为275nm处用蒸馏水做参比测出滤液的吸光度A1。空白试验：吸取式样溶液1.00ml置于10ml具塞比色管中，于37℃±0.2℃水浴中保温10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00ml，摇匀，反应10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00ml，摇匀，于37℃±0.2℃水浴中放置40min，用干燥滤纸滤过，取滤液，在2h内在波长为275nm初拥蒸馏水为参比册数滤液的吸光度A2。酪氨酸标准溶液的吸光度：用蒸馏水做参比，在波长275nm处测定50ug/ml酪氨酸标准溶液的吸光度A3。6、结果计算木瓜蛋白酶活力X1（U／g）按公式计算：X1=1023111)21(mAnmAA式中：A1----木瓜蛋白酶的吸光度；A2----空白试验的吸光度；A3----酪氨酸标准溶液的吸光度；m1----对照品溶液每毫升中含酪氨酸的量，单位为微克；m2----试样的质量，单位为克；n----试样溶液的稀释倍数。7、允许差二次平行测定结果的相对误差应不大于10%，取其算术平均值为测定结果。