本科生自由探索计划项目申请书

中南大学本科生自由探索计划项目申请书项目名称：槲皮素对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其机制研究申报类别：医学申请人：谭航菁联系电话：[phone]学号：2208120831所属学院：湘雅医学院E-MAIL：[e-mail]指导教师：王念电话：[phone]中南大学2014年制填表说明一、本申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要。二、本申请书为大十六开本(A4)，左侧装订成册。可网上下载、自行复印或加页，但格式、内容、大小均须与原件一致。三、“申报类别”包括：数学类、物理类、化学类、医学(含生物)类、信息类。四、“项目性质”包括“新申报”和“滚动项目”两类，在所选性质后的“”标注“”；申报“滚动项目”需在“申请人曾经参与科研的情况”一栏中说明原研究项目名称。五、“项目组主要成员”栏目中在首行填写项目负责人的信息，“出生年月”按“1994-01”的格式填写。六、“指导教师”栏目中填写指导教师(团队)的基本信息，“职称”栏目填写“正高、副高、中级、其他”。七、“经费预算”主要包括：材料费、测试化验加工费、差旅费、会议费、国际合作与交流费、出版/文献/信息传播/知识产权事务费、等。一、基本情况项目名称槲皮素对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其机制研究申报类别医学项目性质新申报滚动项目经费预算10000元项目组成员姓名性别出生年月学号所学专业联系电话项目分工谭航菁女1994-092208120831临床医学13973204790项目负责人、动物模型的构建及分子生物学指标检测彭晓逸女1994-052208120703临床医学18874164347动物模型的构建及分子生物学指标检测薛健博男1993-062208120704临床医学15211134796细胞培养及分子生物学指标检测孙洪香女1994-072208120119临床医学18774842164细胞培养基分子生物学指标检测指导教师姓名职称学位联系电话电子邮箱王念中级博士[e-mail]申请人曾经参与科研的情况指导教师承担科研课题情况主持国家自然科学基金：白藜芦醇对脓毒症时胰岛素抵抗的作用及其机制研究(81000846)和湖南省自然科学基金：白藜芦醇调节脓毒症时葡萄糖稳态的作用及其机制的实验研究(12JJ4084)。项目简介(100字左右)糖尿病性视网膜病变与血管过度增生有关，可导致糖尿病患者严重的视力下降甚至完全失明，严重影响患者的生活质量，因而深入探讨其发病机制和寻找其有效的治疗靶点和药物具有十分重要的临床意义。槲皮素是一种广泛存在于植物中的具有抑制血管新生、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性的黄酮类化合物。本研究将首先采用在体动物实验探讨槲皮素对糖尿病性视网膜病变的保护作用；再进一步通过离体细胞实验探讨槲皮素对高糖和高胰岛素诱导的血管内皮细胞内质网应激、VEGF的表达、管型形成和细胞迁移的影响；旨在证实槲皮素通过抑制内质网应激，下调VEGF的表达，减少血管新生，进而发挥对糖尿病性视网膜病变的保护作用，以期为糖尿病性视网膜病变的临床防治提供参考依据。二、课题论证(5000字左右)1研究目的和研究意义糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的严重危害人类健康的常见病、多发病。目前，全世界大约有4亿糖尿病患者，据国际糖尿病联合会估计，现在全球约8.3％的成年人患有糖尿病；预计到2035年，糖尿病患者人数会上升至5.92亿[1,2]。我国是世界上糖尿病患者最多的三个国家之一，随着人口老龄化、饮食结构西化和久坐等不良生活方式的流行，T2DM患病率上升的势头有增无减，其中90%以上为2型糖尿病(type2diabetes，T2DM)，其并发症可累及机体各重要器官，也因此成为继癌症和心脑血管病之后威胁人类健康的第三大“杀手”[3]。2013年，糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有１人死于糖尿病，而大多数糖尿病患者死于其并发症。2010年，据美国糖尿病协会(ADA)统计数据显示，3年以上的糖尿病患者出现并发症的几率在46%以上；5年以上的糖尿病患者，出现并发症的几率在61%以上；10年以上的糖尿病患者，出现并发症的几率高达98%。自胰岛素治疗应用于临床以来，糖尿病急性并发症的死亡率明显降低，而糖尿病慢性并发症已成为糖尿病患者致死，致残的主要原因，包括糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变，糖尿病足等[4]。其中，糖尿病性视网膜病变是糖尿病性微血管病变中最重要的表现，可导致糖尿病患者严重的视力下降甚至完全失明，严重影响糖尿病患者的生活质量[5]。因此，深入探讨糖尿病性视网膜病变的发病机制和寻找其有效的治疗靶点和药物具有十分重要的临床意义。糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)是一种具有特异性改变的眼底病变，临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志，将其分为非增殖性糖尿病性视网膜病变(NPDR)(或称单纯型或背景型)和增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)[6]。在PDR中，视网膜损害可刺激血管新生，而这些新生的血管对视网膜有害无益，可诱导纤维增生，甚至导致视网膜脱离；此外，新生血管也可长入玻璃体或引起玻璃体出血[7-9]。因此，PDR对糖尿病患者视力的危害性较NPDR更严重。由此可见，具有抗血管新生活性的药物可能对这种糖尿病性PDR具有一定的保护作用，有助于改善2型糖尿病患者的生存质量。槲皮素(quercetin)及其衍生物广泛存在于许多植物的花、叶、果实中，如芦丁、槲皮甙、金丝桃甙等，多以甙的形式存在，是具有多种生物学活性的黄酮类化合物[10]。近年来，国内外对槲皮素的研究发现其具有抗氧化、清除氧自由基、抗纤维化、抗肿瘤、降血压、保护心肌缺血再灌注损伤、抗病毒以及抑制血管新生等多种生物学活性，且对人体无毒、无害、无致癌、无致死、无致畸性等[11-12]。因而槲皮素逐渐受到了研究者们的广泛关注，特别是其对血管新生的抑制作用，已成为其应用于抗肿瘤治疗的基础。而槲皮素对糖尿病性PDR的影响目前少有研究报道。因此，本研究旨在探讨槲皮素对糖尿病性PDR的影响及其可能的作用机制，以期为糖尿病性PDR的临床防治提供更多的参考依据。2国内外研究现状糖尿病性PDR的发病机制至今尚未完全明了，研究认为主要包括以下5个基本病理过程：①视网膜毛细血管微动脉瘤形成；②血管渗透性增加；③血管闭塞；④新生血管和纤维组织增生；⑤纤维血管膜收缩。患者的临床征象取决于这5个过程的相对表现。糖尿病时，长期高血糖刺激会损伤全身微小血管内皮细胞，导致血管壁增厚、弹性下降，甚至血管硬化，引起微循环障碍。由于视网膜的血管是终末血管，而视网膜细胞新陈代谢旺盛，耗氧量大，故微循环障碍对视网膜组织影响十分突出：一方面机体需要大量血液氧气，另一方面供给线路发生故障，无法提供足够新鲜血液及氧气，故机体会代偿性产生大量新生血管，以缓解这种供需矛盾。这些新生血管不仅组织结构不够完善，可从静脉发起，或源于一簇细小的视网膜内微血管异常，新生血管的内皮细胞有窗样改变，并且细胞间没有紧密连接，在视网膜内易引起出血，最终导致增殖性视网膜病变的发生[7-8,13-14]。血管新生(angiogenesis)是指从原有的血管上生出新的毛细血管。这一过程包括内皮细胞增殖、迁移、细胞间黏附、排成直线及形成开放的腔样结构，血管基底膜及细胞外基质的降解等步骤。目前研究发现在众多促血管新生的生长因子中，血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)无疑是最强有力的血管生成因子，其促血管生成作用已在多种在体、离体、细胞模型、甚至临床患者中得以证实。VEGF主要通过与其特异性受体VEGFR1和VEGFR2结合，激活细胞内包括PI3K/AKT，ERK，PKC以及Notch/delta等众多信号通路，诱导多个血管新生基因表达，促进内皮细胞增殖、出芽、迁移和形成管腔，并通过增加血管通透性，抑制内皮细胞凋亡等方式促进血管新生[15-19]。研究表明，VEGF在糖尿病性PDR的发生发展过程中发挥了重要的作用[23-25]。如VEGF−460C基因多态性是糖尿病性PDR发生发展过程正相关的独立预测因子，高表达单倍型型，包括−460C增加VEGF的表达可促进糖尿病性PDR时血管新生[23]。在糖尿病患者和动物模型的眼组织中，VEGF的表达均上调，而将VEGF(特别是VEGF165)注入动物的健康眼，可导致其发生糖尿病相关的病理改变[25]。多项研究表明，槲皮素抑制血管新生的作用与VEGF及其受体有关。PoyilPratheeshkumar等研究证实槲皮素可通过调节VEGFR-2介导的AKT/mTOR/P70S6K信号通路抑制血管新生调控的人前列腺癌的生长[20]。钟璐等的研究表明槲皮素在体外可抑制白血病细胞K562分泌VEGF，并诱导其凋亡[21]。JeonH等发现槲皮素能上调结肠上皮细胞和炎症性结肠组织中VEGF的表达，进而缓解结肠粘膜损伤[22]。由此，我们推测槲皮素可能通过调节VEGF的表达，抑制血管新生，进而发挥对糖尿病性PDR的保护作用。那么，槲皮素又是通过何种机制调节VEGF的表达呢？内质网应激(Endoplasmicreticulumstress，ERS)是由于各种原因导致细胞内质网内稳态失衡、生理功能发生紊乱的一种亚细胞器的病理生理过程。适度的ERS反应是细胞的一种自我保护性机制，利于细胞在外界各种因素的刺激下恢复内质网稳态，维持生存；但是过强的或时间过长的ERS反应可以引起细胞的一系列病理表现并引发各种疾病。研究表明ERS不仅是胰岛素抵抗和2型糖尿病在分子、细胞和器官水平上的核心特征，也是其有效的治疗靶点。此外，ERS与癌症、乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、急性缺血性肾疾病等的血管新生均有关[27]。而近年来的研究也显示ERS存在于糖尿病视网膜病变和氧诱导视网膜病动物模型中，与早期糖尿病性视网膜病变密切相关，且可促进视网膜血管新生[26]。ERS相关的重要信号蛋白ATF4可抑制PDR中新生血管的形成[28]，通过siRNA敲除或药物阻滞剂抑制ERS介导的Ire1a或ATF6信号可导致血管新生的减少[29]。进一步的研究证实VEGF是ERS反应基因，特别是ERS中的ATF4信号可上调VEGF的表达，因而影响血管新生[29-31]。而槲皮素可通过调节肾小球内皮细胞中ERS抑制不对称二甲基精氨酸诱导的细胞凋亡，通过抑制ERS-CHOP信号保护氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡以及人前列腺癌PC-3细胞凋亡等[32-34]。鉴于此，本研究提出以下假说：糖尿病时，ERS信号过度活化后上调VEGF的表达，进而促进血管新生，导致增殖性视网膜病变；而槲皮素可能通过抑制内质网应激，下调VEGF的表达，进而减少血管新生，改善或缓解糖尿病性增殖性视网膜病变。参考文献[1]PrevalenceofDiabetesintheWorld,2013.[2]J.E.Shaw,R.A.Sicree,P.Z.Zimmet.Globalestimatesoftheprevalenceofdiabetesfor2010and2030.DiabetesResearchandClinicalPractice.2010;87(1):4-14.[3]XuY,WangL,HeJ,etal.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults.JAMA.2013;310(9):948-59.[4]ByronJHoogwerf.ComplicationsOfDiabetesMellitus.Int.J.Diab.Dev.Countries.2005;25:63-69.[5]DavidM.Nathan.Long-Ter