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以下仅作为写实验论文的范本，具体写作方法请参考教材。内毒素抑制心肌细胞β受体功能及虎杖苷的治疗作用姓名1（学号）姓名2姓名3姓名4姓名5姓名6（注：第一作者必须写在第一位，并附上学号，其余组员不用写学号）临床医学八年制2011级摘要目的通过观察虎杖苷(PD)对正常与内毒素处理的心肌细胞β肾上腺素能受体(β-AR)功能的影响以探讨虎杖苷抗休克作用机理。方法以3H-DHA作为放射配体，通过放射配基竞争结合法检测体外培养的幼鼠心肌细胞β-AR数量和亲和力（Kd值表示）的变化。结果正常心肌细胞膜上的β-AR最大结合容量(Bmax)为4.14±1.41fmol/105cells，解离常数Kd值为4.02±0.59nmol/L;内毒素刺激30min后，受体Bmax减小为1.78±0.12fmol/105cells，亲合力下降为23.88±2.34nmol/L;当用PD处理后，最大结合容量和亲合常数都恢复至接近正常，分别为3.37±0.36fmol/105cells和3.44±0.44nmol/L；单纯用PD处理细胞Bmax和Kd与正常组无显著差别。结论内毒素可直接引起心肌细胞β-AR数量下调、亲和力降低，虎杖苷治疗可纠正内毒素引起的β-AR功能变化。关键词：虎杖苷内毒素心肌细胞β-肾上腺素能受体内毒素可激活体内免疫和炎症反应系统，对机体造成广泛的损害和影响[1]，并使心肌收缩力减弱，心率变慢，严重影响心脏功能[2-3]。本实验室以往对虎杖苷（Polydatin,PD）的研究发现，PD对防治失血性、烧伤性和感染性休克有显著疗效，可以提高休克动物的存活率、改善微循环灌流和增强动物心肌收缩力[4-8]。鉴于β-AR对心肌细胞的收缩舒张有着重要的调节作用，而PD在抗休克过程中也主要是影响了血管平滑肌和心肌细胞的收缩和舒张能力，我们推测PD对心肌收缩力的影响可能与心肌细胞β-AR功能变化有一定关系。因此，我们用内毒素作为损伤刺激作用于离体培养的心肌细胞，体外模拟内毒素休克条件来观察PD对β-AR的影响，以探讨PD抗休克作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物出生3天内SD大鼠幼鼠，由本校动物实验中心提供。1.1.2试剂内毒素100ng/ml(Sigma公司)；PD0.2mmol/L(本校化学教研室提纯制备)；3H-DHA（0.25μmol/mlDihydroalprenolol双氢烯丙洛尔,北京原子能研究所）：比活性为40Ci/mmol；消旋心得安（0.25mmol/ml，DL-proprenolol,Sigma）。1.1.3仪器液闪计数仪LS6500（Beckman,USA）1.2方法（注：相对完整的几个操作步骤写一段，而不要一个操作写一段）1.2.1心肌细胞原代培养参照本室常规方法[9]。即取出生3dSD大鼠幼鼠，无菌取出心脏，用D-Hanks液洗去血液，去外膜后剪碎。加0.06%胰蛋白酶35~37℃消化10min，弃上清。再加酶消化4~5次，每次10min。收集上清加血清终止酶活性。离心5min，用含20%小牛血清DMEM培养基制备细胞悬液。5×105个/ml接种到培养瓶中，置CO2培养箱培养2h后吸出细胞上清，接种到新的培养瓶中继续培养。1.2.2肾上腺素能β-AR的放射配体竞争结合法测定[10]用0.25%胰酶消化心肌细胞,离心后用Tris-HCl溶液制成细胞悬液并计数，按实验设计分组加入刺激。反应在Tris-HCl缓冲溶液中进行。总结合管加入3H-DHA，终浓度分别为5、10、15、20、25nmol/L。非特异管加入同浓度的3H-DHA和千倍浓度的心得安，各管加Tris-HCl缓冲液使反应总体积为500μl。25℃孵育30分钟，立即置冰浴终止反应，并迅速用醋酸纤维素膜负压抽滤，各管加冰Tris-HCl缓冲溶液冲洗3ml×5次，滤膜干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液3ml，用液闪计数仪测定其放射性（dpm）。总结合管与非特异结合管之差为特异性结合β-AR。根据Scatchard公式求出β-AR的最大结合容量Bmax和平衡解离常数Kd。1.2.3分组心肌细胞原代培养3d后，将其随机分为正常对照组、LPS组、PD组和PD治疗组，每组三皿。正常对照组给予D-Hanks处理30min，LPS组用100ng/ml内毒素刺激心肌细胞30min，PD组单用0.2mmol/LPD孵育10min，PD治疗组用同浓度内毒素刺激相同时间后加0.2mmol/LPD孵育10min。1.2.5统计学处理数据用均值±标准差（x±SD）表示，用计算机EXCEL软件和SPSS11.5软件进行统计学分析。2.结果（注：要用文字具体叙述，而不要仅列出图表）2.1正常心肌细胞β受体的配体结合特点经放射配体竞争结合法测定和Scatchard分析，显示正常心肌细胞膜上的β-AR最大结合容量Bmax为4.14±1.41fmol/105cells，平衡解离常数Kd值（表示受体与配体亲合力的大小）为4.02±0.59nmol/L。见图1。图1正常心肌细胞β-AR的Scatchard分析2.2PD对内毒素作用下心肌细胞β受体结合参数的影响结果显示经内毒素刺激30min后，心肌细胞β-ARBmax减小至1.78±0.12fmol/105cells，亲合力下降至23.88±2.34nmol/L，与正常组差别显著；当用0.2mmol/LPD处理10min后，最大结合容量和亲合力都有明显恢复（Bmax为3.37±0.36fmol/105cells，Kd为3.44±0.44nmol/L）；单纯用PD处理细胞Bmax和Kd都与正常组无明显差别。见图2、图3。图2PD对内毒素刺激下心肌细胞β-AR受体最大结合容量的影响（n=3）注:与正常组相比,*p0.05,与内毒素组相比,#p0.05。图3PD对内毒素刺激下心肌细胞β-AR受体亲和力的影响（n=3）注:与正常组相比,**p0.01,与内毒素组相比,#p,0.05。3讨论（注：要围绕结果进行原因原理分析推论，而不要空谈理论）以前研究我们发现虎杖苷可以使心肌细胞收缩频率加快、收缩的程度加强，表明虎杖苷可增强心肌细胞的收缩能力[11]。由于心肌细胞的收缩活动主要通过肾上腺素能β-AR调节[12]。因此，本实验试图探讨虎杖苷是否也通过影响β-AR途径来调节心肌细胞功能，观察了在内毒素刺激下β-AR的变化规律及其PD防治效果。放射配体竞争结合法采用没有亚型特异性的抑制,剂3H-DHA作为β-AR的特异配体，所得结果揭示了有结合功能、有活性的受体的含量和亲和力的变化。实验中我们观察到，用内毒素刺激心肌细胞使细胞搏动减弱，收缩频率变小，甚至停跳。表明内毒素可在细胞水平直接引起心肌细胞的收缩力减弱。此时用Scatchard分析发现，内毒素作用后的心肌细胞其β-AR不仅数目减少而且与配体的亲和力也下降，提示β-AR功能受到抑制。以往的文献中虽也有报道内毒素可使细胞表面β-AR数量减少[13-14]，但未见有亲和力下降的报道。有报道指出，内毒素可以造成细胞膜损伤[15]，使质膜流动性减少，受体的侧向运动减少，使一些原先隐蔽的受体不易向膜表面运动暴露其结合位点，而表现为β-AR的结合容量下调。而内毒素导致心肌细胞β-AR亲和力下降的机制目前尚不清楚。当内毒素损伤的心肌细胞给予虎杖苷处理后，我们发现，PD不仅可以使β-AR数目恢复而且与配体的亲和力也恢复至接近正常，表明PD影响心肌细胞收缩性的作用是与调节β-AR功能和活性密切相关的。但是PD通过什么环节来调节心肌细胞的受体数目及受体的亲和力，以及PD对β-AR信号传导通路的下游有无影响尚不清楚，尚待进一步实验探讨。参考文献(作者1，作者2....论文题目.杂志名称.发表年份；卷（期）：起止页码)1姜勇,RJUlevitch.内毒素介导细胞激活的信号转导:从CD14到p38MAPK通路的研究.生理科学进展.1999,30(1):29-342TangCX,LiuMS.Initialexternalizationfollowedbyinternalizationofβ-adrenergicreceptorsinratheartduringsepsis.Am.J.Physiol,1996,270(39):R2543张曼,金丽娟,金春华.白藜芦醇甙对大鼠内毒素休克的影响.中国病理生理杂志.1997;13(3):245-2484ZhaoKS,ZhuZJ,WooKY,etal.Importanceofenhancingcardiacfunctioninthetreatmentofburnshock-EffectofcrystalN0.4ofPolygonumcuspidatum.InSengChihyoingeds.“AdvancesinBurns”Beijing:InternationalAcademicPublishers.1992,P.31-385ZhaoKS,ZhuZJ,WooKY,etal.EffectofcrystalNO.4ofPolygonumcuspidatumoncardiacfunctionofratswithhemorrhagicshock.JMedCollPLA.1990,5:126黄巧冰,赵克森,黄绪亮.虎杖4号与多巴胺、654-2治疗大鼠失血性休克疗效的比较.第一军医大学学报,1994,14(1):507吴坤莹,赵克森,朱佐江.虎杖4号对烧伤性休克大鼠微循环紊乱的防治作用.中华整形烧伤外科杂志,1992,8(2):1338赵克森,朱佐江,吴坤莹,等.虎杖4号增强烧伤休克早期心功能的效应.中华整形烧伤外科杂志.1989,5:2759金春华,赵克森,刘杰,等.虎杖甙对心肌细胞钙的调节作用.中国病理生理杂志.2001;17(2):128-13010NajahA-G,ThomasE,LeifH-M,etal.MethyleneblueIsaMuscarinicAntagonistinCardiacMyocytes.MolecularPharmacology.1997;52:482-49011金春华,刘杰,黄绪亮,等.虎杖苷对心肌细胞收缩性的影响.中国药理学通报.2000,16(4):400-40212吕宝璋,卢建,安明榜.受体学.第1版.合肥.安徽科学技术出版社.2000:134-14113肖贞良,孙耕耘,黄碧琼.炎性损伤对肺微血管内皮细胞β-受体的影响.解放军医学杂志.2000;25(2):100-10214孙耕耘,肖贞良,方传彪.山莨菪碱对内毒素致肺微血管内皮细胞骨架变化的影响.中国药理学通报.2001;17(2):197-19915邢成,吕宝璋.热应激时大鼠肺组织中β-肾上腺素受体的变化与膜磷脂代谢的关系.生理学报.1992;44(1):39-44