蛋白纯化系统

2019年12月25日星期三BioLogicDuoFlow中高压层析系统层析原理与操作为什么做蛋白质纯化？原理与操作纯度均一的蛋白质才能满足物理化学性质研究、生物活性测定、免疫学性质、结构分析、药理毒理实验的要求，以揭示生命科学的规律。研究开发、中试生产蛋白质药物用于诊断和治疗。实验室研究A、天然生物样品纯度均一的蛋白质纯化B、重组基因工程药物C、蛋白质组研究差异蛋白质质谱测序克隆表达分离纯化蛋白质是生命科学研究的基本且必要的技术手段，也是生物制品药物生产的最重要的工艺步骤！其他生物分子分离纯化原理与操作其他生物大分子：DNA，多糖生物小分子：多肽和小肽，核苷酸，寡糖和单糖，多环和杂环用途：用于性质、活性等研究需要用于治疗和诊断的药物用于生物、化工或食品等轻工领域的生化试剂离心沉淀超滤电泳层析(Chromatography)生物分离纯化技术原理与操作Model491，RotoforNote:蛋白质分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件，从而保证在此过程中蛋白质的结构和活性不受影响。最广泛的蛋白质分离纯化方法条件温和维持蛋白质空间结构与活性什么是生物层析•根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离–极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP–离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX–大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF–结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC•这些特性的区别使不同生物分子分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作层析技术•IonExchange(IEX)－离子交换–电荷–可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化•SizeExclusion(SEC)－分子筛（或凝胶过滤）–分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化•Affinity(AC)－亲和–生物相互作用–用于复杂样品的最早捕获或中间纯化•HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水和反相–疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖•CeramicHydroxyapatite(CHT)&CeramicFluoroapatite(CFT)－羟基磷灰石–独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化原理与操作层析的5个操作步骤•装柱并平衡•上样•平衡•洗脱•再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作原理与操作层析图第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量(A280),由UV检测器读出，y轴基线洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉时间或体积，x轴液相层析系统的工作流程用Pump推动溶液…各种Valve系统选取溶液控制流向通过Column时不同蛋白分子与填料作用强度不同因而迁移速度不同从而分开…Column洗脱液包含的蛋白….通过检测器确定位置和浓度FractionCollector收集样品原理与操作液相层析系统仪器结构DuoFlow10/40系统DuoFlow工作站电导检测器MX-1梯度混合器AVR7-3样品进样阀USBBitbus信号转换器液晶显示器电脑BioFrac方形组分收集器UV检测器DuoFlow中高压层析系统Maximizer阀系统QuadTec紫外/可见检测器Maximizer混合器SV5-4阀AVR9-8阀pH检测器DuoFlowBasicDuoFlowQuadTecMaximizerPathfinderDuoFlow中高压层析系统工作流程DuoFLow生物相容性100%bio-compatible所有接触溶液的系统以新型塑料peek为主溶液系统不接触任何金属件，避免蛋白变性和吸附化学稳定性化学稳定性基本特征DuoFLow兼容所有层析填料基本特征DuoFLowF10梯度泵：20.0ml/minat3500psi(233bar,23MPa)高压中流速的泵头可满足HPLC高压液相分析和小规模制备的要求F40梯度泵：80ml/minat1000psi(66bar,6.6MPa)中压高流速的泵头可满足大规模制备，包括中试和生产的要求DuoFLow特色:可更换的双泵头只要旋下泵头前的4根螺丝，将另一泵头安上即可实现高压中流速和中压高流速的切换DuoFlow可将高压中流速和中压高流速两种仪器的性能通过独特的泵头更换技术整合在一台仪器中。灵活多样、功能强大的扩展配置DuoFLow特色EasytolearnSoftware强大的分析、管理和报告功能，通过软件整合和控制所有硬件:Maximizer,QuadTec,2128,BioFrac,pHMonitor,allvalves……DuoFLow特色Maximizer使F10和F40梯度泵流速增加一倍，压力不变情况下达到20ml/minor80ml/min，用于工艺优化、中试放大四元缓冲液梯度混合，寻找最佳PH和离子强度以优化工艺增加阀的数量，达到6低压6高压阀，灵活配置你的层析系统连接第三方检测器DuoFLow功能组件MaximizerDuoFLow功能组件Peek材质，良好化学稳定性密封的甘汞电极防止电极液干涸甘汞不与混冲液中的金属离子结合，防止堵塞响应时间提高，检测结果更加准确和精确PH检测器DuoFLow功能组件检测范围：pH0－14检测灵敏度：0.01UV、电导检测器标配254/280nm滤光片检测DNA、蛋白214nm+锌灯选件检测肽链滤光片选件313nm356nm405nm436nm546nm外接其它检测器，如折光仪DuoFLow功能组件QuadTecUV/Vis检测器同时四波长检测——DNA,peptides,Proteins……DuoFLow功能组件波长范围：190-740nm四波长同步检测波长精确性：1nmWavelengthAbsorbingSpecies206nm214nm224nm245nm254nm260nm280nm313nm365nm405nm550nmCarboxylgroups,esterlinks,amideorpeptidebondsPeptidebondsPeptidebondsProteinsinthepresenceofTrionX-100Nucleotides,NucleotideBases,DNA,RNANucleotides,NucleotideBases,DNA,RNAProteinswithAromaticaminoacidsCertainVitamins,AntibioticswithConjugatedringsystemsSomesteroids,NADH,NADPH,flavoproteins,bacteriochlorophyllswithConjugatedringsystemsMyoglobinwithHemegroupCytochromesDuoFLow功能组件QuadTec14种可选收集架，可以放冰浴，保证样品活性整合在duoflow中，多种程序(窗口和阀限)收集可用在HR,LP,Econo中BioFracFraction组分收集器DuoFLow功能组件DuoFLow功能组件BioFracFraction组分收集器Make-before-break高压阀AVR7-3高压上样阀AVR9-8高压转换阀各种低压阀SV5-4低压阀，缓冲液选择SVT3-2低压阀，溶液选择或转向灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统DuoFLow功能组件——阀系统2xAVR7-3阀构建逆向层析系统，用于亲和层析仅需切换第二个AVR7-3阀位置即可DuoFLow阀系统2xAVR9-8实现8柱切换DuoFLow阀系统DuoFLow阀系统AVR9-8辅助泵实现自动切换上样DuoFLow阀系统：柱串联去除血清中高丰度蛋白：IgG和HSA以用于2D电泳分析DuoFLow阀系统：柱串联利用各种阀构建级联层析系统，实现特定目的A:样品经阀1柱1阀3阀4收集器B:特定组份经阀4阀2Loop柱2阀3、4收集器前一柱子流出的特定组份直接上第二根柱子二次分离DuoFLow阀系统阀系统：2D-LC（LiquidChromatography）-0.250.000.250.500.751.001.25AU-2.50.02.55.07.5pH-10.00.010.020.030.040.050.060.070.0%BufferB30.0060.00Min.TenthARackPos.:Tube#:1A357911131517192123252729313336454749515355575961636567697173757779818385Fractions样品：蛇毒1DColumn：UnoQ强阴离子交换柱2DColumn：Hi-PoreRP318C18反相分析柱1D柱第11组分由阀门导向样品环中，继续1D色谱分析，完毕后，自动进行2D反相柱的平衡，然后进样（1D第11组分），进行2D反相分析。第一维色谱，UNOQ1离子交换第二维色谱，RPC18反相，第一维11管组分在第二维分成多个组分第一维第11管组分1mL经过检测器后没流到收集器中，而是流到第二维色谱的进样环中，所以以空白表示，没标以灰色DuoFLow3XAVR7-3实现三柱级联前一柱子未结合的蛋白进入第二、三根柱子，三根柱子可以独立洗脱第一根柱子独立上样、洗脱，组份经换向阀进入第二根柱子，独立洗脱，组份经换向阀进入多三根柱子，独立洗脱收集DuoFLow阀系统BioLogicDuoFlowBasicSystemBioLogicDuoFlowStandardSystemBioLogicDuoFlowQuadTecBasicSystemBioLogicDuoFlowQuadTecStandardSystemBioLogicDuoFlowMaximizer20SystemBioLogicDuoFlowMaximizer80SystemBioLogicDuoFlowPathFinder20SystemBioLogicDuoFlowPathFinder80System一套组件，根据需要配置多种平台，组件共享，资源共享…DuoFLowDuoFLow软件系统非常直观，易学简单明快，4个步骤进入操作：BrowserSetupProtocolRun观察样品情况,调节色普图和峰高度orGoDoSomethingElse!2次击键进入操作:BrowserRun观察样品情况,调节色普图和峰高度orGoDoSomethingElse!DuoFLow软件系统ManualScreenDuoFLow软件系统Browser–EnterUserandMethodNameDuoFLow软件系统Setup–selecthardwareDuoFLow软件系统Protocol–entermethodDuoFLow软件系统PostRunOptions-ActivityDuoFLow软件系统PostRunOptions–PeakTaggingDuoFLow软件系统PostRunOptions–TRACECOMPARE层析图比较单一柱子单一程序走不同样品单一样品和单一程序走不同柱子同一样品和柱子走不同程序DuoFLow软件系统DuoFLow软件系统DuoFLow软件系统液相层析系统应用层析是如何物质实现分类•根据分子物理化学特性的不同而达到分离–极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP–离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX–大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF–结构特征与活性位点：shape(ligan