AKTA蛋白纯化系统操作

AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTAEXPLORER、AKTAPILOT、AKTAPURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTAEXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。1、认识AKTA。AKTAexplorer是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig1）。它们是：FIG1、AKTAEXPLORER主机•Pump-900为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer100，流速范围0.01-100ml/min，压力高达10Mpa（泵名为P-901）。在AKTAexplore10，流速范围0.001-10ml/min，压力高达25Mpa（泵名为P-903）。•MonitorUV-900，同时监控190－700nm范围内高达3个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTAPURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）•MonitorpH/C-900，在线电导和pH监测的组合监测器。Fig2、AKTAEXPLORER硬件模式图AKTAEXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICORN软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。2、一般操作2.1开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig3）Fig3、Unicorn的操作界面2.2准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45µm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。2.3清洗及管道准备首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在systemcontrol窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pumpwashexplorer，选中A1,B1管道为ON，execute。泵清洗将自动结束。(Fig4)Fig4、AKTAExplorer的泵清洗操作2.4安装层析柱在manual里选择pump→flowrate，输入一定的低流速（Fig5），insert；选择Alarm&mon→alarmpressure，设置highalarm（输入填料或层析柱的耐受压力，以较低者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到），insert，execute（Fig6）。待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。Fig5、AKTAExplorer的流速设定操作Fig6、AKTAExplorer的限压设定操作2.5开始纯化：1）在柱子平衡好之后（电导，pH的数值和变化趋势稳定）即开始上样了。此时应将紫外调零（Fig7），选择Alarm&mon→autozero，exectue。Fig7、AKTAExplorer的紫外调零操作2）具体上样方式：AKTA系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等，这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。点击pause，将A1放入样品中，点击countine，待样品上完后，再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子。3）洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在manual里选择pump→gradient，按照自己的工艺选择targetB（100％）和length（10CV）（Fig8）。Fig8、AKTAExplorer的洗脱条件设定操作4）设定收集：选择Frac→fractionation_900,输入每管收集体积，exectue（Fig9）。结束固定体积收集选择Frac→fractionation_stop_900，exectue（Fig10）。Fig9、AKTAExplorer的组分收集设定操作Fig10、AKTAExplorer的组分收集停止设定操作5）清洗泵及卸下层析柱：将A1和B1入口放入纯水中，启动pumpwashpurifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后再将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。再给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程中应防止气泡进入。6）关闭电源：从软件控制系统的第一个窗口unicornmanager点击退出，其他窗口不能单独关闭。然后关闭AKTA主机电源，关闭电脑电源。3、程序设定操作在methodeditor窗口点击工具栏内的methodwizard，弹出窗口界面如Fig11所示，可以分别在mainselection、column以及columnposition三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置，选好之后，点击next按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Fig12），在此可以设定检测的波长，针对AKTAEXPLORER可以一次选择三个波长共同进行监控，并在此设定A泵和B泵的溶液进口，设定好之后，点击next，出现如Fig13所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。Fig11Fig12Fig13Fig14完成之后，点击next出现Fig14的窗口，在此可以设定上样的条件，可选择的条件包括上样的方式，如上样环上样以及样品泵上样，对上样的体积也要进行设定。如果利用系统泵上样，在此无法进行设置，不过可以利用A泵和B泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。在上步设置完成之后，点击NEXT出现如Fig15所示窗口，这里是针对流穿组分收集所进行一些设置，针对安装的不同的收集器，具体内容可能有些差异，这里显示的界面是在安装了Frac-950收集器之后所出现的界面，设置完成点击NEXT出现如Fig16所示的窗口，设置目标组分收集的一些参数，点击NEXT，出现如Fig17所示的窗口，针对具体的洗脱条件可以进行设置。当全部设置完成之后，点击finish，弹出Fig18所示的窗口，可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改，完成之后点击按钮，完成程序存盘操作。至此完成洗脱程序的设定工作，在应用自动洗脱程序时，可在SYSTEMCONTROL窗口点击文件菜单栏中的FILE→Run，在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行，之后会依次弹出一些对话框，主要是再次确认程序的设置条件，并选择洗脱结果文件的保存位置，全部设置完之后，洗脱将自动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中。Fig15Fig16Fig17Fig184、结果的浏览与简单处理在纯化完成后，Unicorn软件会自动的按照预先的设置保存结果文件，如果没有指定，那么结果文件会保存于一个文件名以manualN开头的文件中，N为系统依次生成的一个1-10之间的数字。对于结果的浏览应在evaluation窗口（Fig19）中进行，打开文件及对文件进行普通编辑的菜单如Fig20所示。Fig19Evaluation窗口Fig20纯化结果普通编辑菜单这里已经选择了一个纯化文件，打开后，在结果浏览窗口点击鼠标右键，选择properties，可以弹出如Fig21所示的操作菜单，可以分别对结果进行编辑，如改变曲线的颜色，设定横轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等。Fig214、AKTA蛋白纯化系统的日常维护4.1每天，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用SystemWashMethod完成以蒸馏水将系统彻底清洗，再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗。4.2每周更换润洗缓冲液（20%乙醇）。若发现储液瓶液体增多，就说明泵内部有漏液，需要更换泵密封圈。若发现液体减少，需要检查润洗管接头，如果没有漏液，则泵膜或密封圈需要更换。4.3一定要保持实验环境的清洁，以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏。4.4在长时间不应用系统进行试验的时候，应将系统管路充满20%的乙醇，并关闭紫外检测器，清洗PH探头，并保存于适当的缓冲液中。