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大豆组织再生体系建立摘要：大豆组织再生体系的建立，对大豆育种及大豆遗传转化都具有重要意义，但大豆再生的效率却不高。本文研究确定了使用Cl2和5%的NaClO二次消毒法进行种子消毒，确定大豆子叶节发芽时在基本培养基的基础上添加2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA。确定了大豆生根的最佳浓度是加入0.1mg/L的IBA，并且使用下胚轴、子叶进行愈伤组织的诱导，但还未诱导出芽和根，还有待进一步研究。关键词：大豆种子；子叶节；植物激素；再生引言大豆中富含蛋白质及油脂还有一些其它的矿物质和维生素，它是主要的油料作物和植物蛋白的来源，是一种高蛋白，高脂肪的作物，营养价值和经济价值都很高。大豆制品是人们生产生活不可或缺的食物，大豆制品更是风靡全球，走入寻常百姓家。但是，大豆受虫害，农药影响严重，同时由于我国大豆生产规模小、效益低、大豆品质参差不齐，导致我国的大豆生产远远落后于国内其他粮食作物的发展。所以我们对大豆的再生体系进行研究，生产高产的大豆植株。目前，对大豆的研究很多，但是大豆再生的效率依然很低。为此，本课题主要研究大豆再生体系的建立，通过对子叶节、下胚轴、子叶等不同外植体进行再生体系的研究，探索适合大豆分化的激素浓度及培养基成分，可以高效地规模化地再生大豆植株，为大豆遗传转化以及转基因大豆的规模化生产奠定研究基础。1大豆及其简介大豆(Glycinemax(L．)Merrill)属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n=40)植物，在世界各国广泛种植【1】。它起源于中国，后相继传入日本、欧洲和美国等，其种子(大豆)是人类主要的植物性蛋白质来源，也是重要的家畜饲料和工业原料，具有很大的医学价值[2-3]。为此，人们对大豆的组织培养进行了广泛研究。20世纪60年代，人们曾采用大豆的各种外植体进行培养，而再生效率普遍较低，且重复性较差，20世纪80年代以来，大豆再生体系的建立获得了很大的进展。1.1大豆的营养价值大豆中含有40%蛋白质，是其它谷类蛋白的4-5倍，其蛋白质中必需氨基酸含量丰富，大豆蛋白属于优质蛋白。而且大豆中含有不饱和脂肪酸，富含卵磷脂，含有丰富的亚油酸，它具有降低胆固醇含量和预防心血管疾病的功效。大豆中富含B族维生素、抗坏血酸、烟酸等，无机盐和微量元素也很丰富。大豆异黄酮是大豆生长过程中产生的一种此生代谢产物，它具有弱雌性激素活性，和抗氧化的活性，以及抗溶血和抗真菌的活性。大豆异黄酮对很多疾病都有抑制作用，例如对乳腺癌的治疗作用。大豆皂甙，可以提高人体免疫力。大豆中的卵磷脂可除掉附在血管壁上的胆固醇，防止血管硬化，预防心血管疾病，保护心脏等。大豆制品适用于各种年龄段的人群，在国内市场上，大豆的制品的生产发展迅猛，势如破竹。1.2大豆的应用大豆在生产上的应用范围很广泛。大豆的油脂，在工业中，主要应用于颜料，在生产彩绘中使用这些颜料，我们日常应用的打印墨也来源于油脂的再加工，还有肥皂、各种消毒以及杀虫的药剂等等。大豆的油脂在工业中的应用还可以产生须有高价值的副产品，例如磷酸卵磷脂，它可以在食品、化妆品、油漆、制药、洗涤等等方面起到保湿以及稳定的效果。大豆中大量的蛋白可以做成纤维、防水、防火等用品。从50年代起，世界上对大豆的需求一直呈增长势头，大豆已跻身于世界主要商品农作物之林[3]。2植物组织培养植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的培养基里培养成完整的植株。植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及“再生作用”，以此理论为基础，本课题利用大豆的子叶节、下胚轴、子叶等再生大豆植株。而植物组织培养是再生技术的核心。植物组织培养主要包括器官培养、组织培养、胚培养、茎尖培养、花药培养和细胞培养等类型。植物组织培养技术主要是在无菌无毒的环境下，进行离体培养，培育出完整植株。2.1植株组织培养的应用植物组织培养在植物脱毒和快速繁殖上应用最多，可以利用离体的外植体再生脱毒苗，再利用脱毒苗进行繁殖。另外，植物组织培养还更多的应用在育种上，如单倍体育种，发展人工种子等使经济作物的生产产量大幅提高。利用组培技术来生产药物，生产和提取植物的次生代谢物，满足医药方面的需求量，也可以保护野生药用植物。组培技术也在植物基因转化中也是必不可少的，植物基因转化可以改良作物的抗逆性，提高作物的品质，生产出优良的作物。2.2植物组织培养存在的问题在植物组织培养过程中，主要存在着三个方面的问题。其一是污染问题，污染问题是植物组织培养过程中的常见问题。造成污染的原因有很多，例如器皿消毒不彻底，外植体消毒不彻底，操作不规范等都可能导致染菌。所以在进行组培之前，我们要对外植体进行彻底的消毒，杜绝可能的污染因素。其二是外植体发生褐变，注意切割外植体时，减小其面积，另外选用合适的消毒剂进行消毒，用酒精消毒时间过长易导致褐变。其三是玻璃化现象，组织结构发生畸形变化。玻璃化的原因很复杂，我们可以通过配置固体培养基，提高蔗糖浓度，降低湿度等来减少玻璃化现象。笔者通过深入研究植物组培过程中存在的问题，在批量接种的过程中，制定了详细的实验方案，并按照操作规范的进行操作，降低实际操作过程中的污染率、褐变率以及玻璃化现象，切实提高实验效率。2.3植物激素与愈伤组织的分类植物激素是对植物的生长和分化有生理生化作用的微量物质，它分为生长素，细胞分类素，赤霉素，乙烯和脱落酸等五类。使用不同浓度的植物激素时，会形成不同的愈伤组织。我们将愈伤组织分为3种类型[10]:I型的结构致密、复杂多样、生长缓慢,通过器官发生途径分化出芽和根,它产生胚状体较少，不易长期继代培养。Ⅱ型的结构松散、易碎、呈颗粒状、生长较快，长期继代培养仍有胚性，能通过胚状体途径再生植株,当2，4-D浓度为5mg/L时，形成这种类型的愈伤组织。Ⅲ型的结构粘软、水浸状、白色透明或半透明，容易继代培养，但几乎丧失分化的能力，为非胚性愈伤组织。当2，4-D浓度为8～12mg/L时形成这种类型的愈伤组织[11]。在本课题中，我们可以根据植物激素的不同浓度来设计正交实验，来得出诱导愈伤组织的最佳浓度。3大豆组织培养研究进展在20世纪60年代，我国刚开始进行大豆的组织培养的研究，在整个发展过程中，不同种类的外植体的组织培养都很困难，再生植株的效率都不高，通过20多年的探索，到了80年代中后期，农业学家终于在大豆组织培养工作中取得了巨大的进展[6]。在1983年，Christionson等[4]利用未成熟合子胚首次得到了再生植株，大豆组织培养取得了突破性的进展[5-6]。Chengetal[7]和Wriyhsdetalt[8]以成熟胚的子叶节诱导出了大量的丛生芽。科学家Kimetalt[9]把含有一个子叶的初生子叶节培养在改良的MS培养基上，也诱导出了大量的丛生芽。由此大豆组织培养进入了新的发展道路，我国的组织培养技术不断提高。越来越多的科学家进行组织培养的研究。3.1大豆再生体系的研究现状目前大豆再生体系主要包括:大豆体细胞胚发生系统、原生质体发生系统和大豆不定芽器官发生系统,其中大豆不定芽器官发生系统是目前公认比较成熟、易行的大豆再生体系。不定芽器官发生系统中,把分生组织和有分化潜力的表皮，亚表皮细胞作为转化的外植体[12]。Barwale等[13]用未成熟胚、子叶来进行植株的再生。Wright等[14]用上胚轴和初生叶、McCabe[15]用幼胚轴、以及Kim等(1990)[16]以下胚轴相继通过器官发生途径获得再生植株。但由于大豆再生体系受不同基因型、不同外植体、不同激素浓度和不同培养基等诸多因素的影响,大豆再生体系的再生效率仍不是很高。目前仍然是公认的再生困难的作物之一。因此,，进一步研究和优化大豆组织培养，建立新的、高效稳定的再生体系是十分必要的，同时也是大豆遗传转化成功的前提和基础[17]。3.2大豆不定芽器官发生系统大豆不定芽器官发生途径是通过诱导外植体产生不定芽，再诱导芽产生根，从而形成完整植株，是比较成熟的大豆再生体系。至今通过该途径已相继从成熟胚子叶、无菌苗子叶节、胚轴、初生叶等外植体获得再生植株[18-19]。虽然大豆再生体系研究取得了一定进展．但由于大豆组织培养再生困难，可重复性差，基因型之间差异大，因此深入研究和优化大豆再生体系是十分必要的。3.3大豆下胚轴、子叶再生体系大豆的下胚轴再生体系是以幼苗的下胚轴和生长点部位作为外植体的另一种不定芽器官发生途径的再生体系。科学家Dan和Reichert建立了以下胚轴为外植体经过器官发生途径的高效大豆再生体系[20]。目前利用下胚轴进行遗传转化的实验有很多，所以，亟需建立一个高效的下胚轴再生体系。还有的以子叶作为外植体,用于遗传转化，主要是基因枪法的转化，子叶的叶片面积小，较为经济，同时它还可以克服以子叶节诱导丛生芽转化所产生的嵌合体。子叶再生体系的研究也是今后研究的一个主要方向。3.4大豆子叶节再生体系大豆不定芽发生系统中，最常用的就是子叶节再生体系，现今已对大豆子叶[20]、子叶节[21]、上胚轴[22]、茎尖[23]和未成熟种子的子叶[18]及茎尖[24]等不定芽器官发生再生系统进行了研究。大豆子叶节是理想的外植体来再生大豆植株。能够提高大豆再生的效率。子叶节再生体系的优点有很多：一是再生时间短，通常2个月就可获得完整的再生植株。二是外植体容易获得，不受季节限制。三是不易变异，遗传稳定性好，诱导率高。四是它的再生过程简单，只需经过丛生芽分化培养、芽伸长及生根培养这3个步骤。最后是它的再生频率高。但是在遗传转化过程中，子叶节不定芽再生系统的外植体较大，存在再生芽之间的保护作用以及外植体本身抗性对于转化后的筛选工作不利，另外还存在由于不定芽多数为多细胞起源，转化后，一般为嵌合体，纯化、筛选难度大。4本课题研究的目的和意义本课题主要研究的是大豆子叶节再生体系的建立，同时与叶，芽再生体系的建立进行对比。以及不同植物激素浓度对大豆生根发芽的调节作用，优化培养基成分，建立最优的再生体系。大豆在人们的生产生活中是必不可少的，所以，我们研究大豆再生的意义，有三点，第一是提高绿色生活的品质和质量，大豆制品是绿色的牛奶，营养物质含量丰富，大豆也可以避免心脑血管的疾病，有益人体健康的绿色食品。第二是大豆再生体系的建立，对于育种的发展，我们可以选取不同的基因型来进行再生，检测不同基因型大豆的出芽率，生根率等，选出有利于生产的高效大豆种子。第三是大豆再生体系的建立，对于大豆遗传转化的研究，意义重大。遗传转化的成功与否取决于大豆再生体系的建立，及再生的效率，有效发展转基因和具有抗逆性的大豆。参考文献[1]李茂福,李睿,傅永福,等．农杆菌介导的大豆遗传转化研究进展[J]．山地农业生物学报,2006,25(4):183~186．[2]王罡,王萍,蔺,等．大豆基因型对根癌农杆菌菌株敏感性的研究遗传[J].2002,24(3)：297~300．[3]孙炳君.大豆遗传转化的研究进展[J].2012,35(6):270~290.[4]ChrisfiansonML，WamickDA，CarlsonPS．Amorpho-genetieallycompetentsoybeansuspensionculture[J]．Science,1983,1983,222：632-634．[5]周思君,尹光出,雷勃钧,等．从大豆幼胚诱导胚胎发生再生体系[J].大豆科学,1989,8(1)：39~44．[6]周思君,尹光出,雷勃钧,等．从大豆幼胚诱导器官发生再生植株[J]．大豆科学，1990,9(4)：285-290．[7]ChengTY,SakaH，Voqui-DinhTH．Plantregenerationfromsoybeancotyledonarynodesegmentsinculture[J]．PlantScienceLetter,1980,19：91-99．[8]WrightMS．InfluencingfactorsontheefficiencyofAgrobaeteriummediatedsoybeantransformation[J]．