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上海大学2015～2016学年秋季学期研究生课程考试（小论文）课程名称：分子细胞生物学课程编号：12S009001论文题目:玉米AP03基因的图位克隆与功能分析研究生姓名:(签名)学号:15722370论文评语:成绩:任课教师:评阅日期:玉米APO3基因的图位克隆与功能分析作者：帅碧莲单位：上海大学生命科学院摘要玉米是重要的粮食和饲料作物，籽粒是其产量的直接决定器官。有关玉米籽粒发育的研究一直以来都是玉米研究的重点和热点。在本课题组前期的研究中，利用Activator/Dissociation(Ac/Ds)转座系统创建了插入突变体库，并从中筛选了一批籽粒发育突变体，shu00067就是其中一个defectivekernel(dek)突变体。籽粒的石蜡切片分析表明，该突变体籽粒中多个组织的发育受到了影响，如：糊粉层细胞缺失或形成不连续的糊粉层；基部胚乳传递层细胞（basalendospermtransferlayer,BETL）发育受阻，胞内突（cellwallin-growths）的减少，以及胚的发育受阻。前期的共分离分析表明shu00067的dek突变表型不是由Ac的插入引起的，因此我们利用转座子标签法结合图位克隆法克隆了该基因。该基因的编号为GRMZM2G351454。在shu00067突变体中，一个Ds插入到GRMZM2G351454起始密码子ATG后156位和157位碱基之间。通过回复突变体的筛选，证明了GRMZM2G351454中Ds的插入是导致shu00067dek突变的原因。进化树分析表明，GRMZM2G351454属于accumulationofphotosystemone(APO)家族的一个成员，其与拟南芥的apo3的相似性最高，因此将GRMZM2G351454命名为ZmAPO3。通过RT-PCR，表明在apo3突变体中没有APO3RNA的积累，而利用westernblotting不能在突变体中检测到APO3蛋白，表明apo3突变体是一个功能丧失的突变体。APO家族有四个已知的成员包括APO1到APO4。其中APO1和APO2定位于叶绿体，而预测APO3和APO4定位于线粒体。我们将ZmAPO3与CFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达，证明了ZmAPO3定位于线粒体中。APO家族的各个成员都具有一个植物中特异的RNA结合结构域DUF794，并且已有报道ZmAPO1参与了叶绿体中几个II型内含子的剪接，我们利用RT-PCR分别检测的野生型和apo3突变体的未成熟籽粒中，所有线粒体编码基的内含子的剪切情况，发现在apo3突变体中，只有线粒体复合物I的NAD7亚基编码基因nad7的第3个内含子完全没有被剪切，表明ZmAPO3参与了线粒体II型内含子nad7int3的剪切。通过westernblotting在突变体籽粒中没有检测到NAD7蛋白。利用BN-PAGE和活性染色发现在apo3突变体中缺失了线粒体复合物I和超级复合物I+III2。通过RNAEMSA，证明了ZmAPO3是作为一个RNA结合蛋白参与了nad7int3的剪切。本研究发现的ZmAPO3是在玉米中第一个参与线粒体编码基因的内含子剪切的蛋白，同时也是第一个被发现的参与nad7int3剪切的蛋白，支持了以往有关线粒体复合物I的对于玉米籽粒发育影响的研究，进而表明线粒体对于玉米籽粒发育的重要性，这个研究结果对于玉米籽粒发育的研究具有重要的意义。相对于目前报道较多的参与叶绿体和线粒体编码基因的编辑和剪切的PPR蛋白家族，APO家族是一类较小的基因家族，只包括4个成员，现在APO1和APO3分别被证明了参与叶绿体和线粒体的编码基因的内含子的剪切。这将为阐明这类蛋白如何参与叶绿体和线粒体编码基因的内含子的剪切以及剪切复合体的构成提供重要的线索。关键词：玉米；Ds；dek突变体;APO3基因;NAD7亚基；线粒体复合物IABSTRACTMaizeisanimportantfoodandfeedcrop,andtheseedisthemostimportantstorageorgananddeterminethefield.Sothedevelopmentofmaizekernelisalwaysthefocusofmaizeresearch.Inthepreviousstudyofourlab,anActivator/Dissociation(Ac/Ds)insertionlibraryofmaizewasconstructed,andmanymutantsofmaizekernelwereidentified.Shu00067isoneofthemaizekernelmutants.ThedevelopmentofmanytissuesofkernelisaffectedintheShu00067mutant,suchasthelossofthealeuronecellandtheformationofdiscontinuousaleurone,thereductionofcellwallin-growthsofbasalendospermtransferlayer(BETL)cellandthedevelopmentdelayofembryo.Theresultofpreviousco-segregantanalysissuggestedthatthemutationofShu00067wasnotcausedbyActransposon,butitmaybecausedbyaDsinsertionforthehighfrequentsomaticrevertant.Soweclonethisgene(GRMZM2G351454)bythecombinationoftransposontagandmapbasedcloning.ADselementinsertsbetweenthe156and157ntoftheCDSofGRMZM2G351454.ThecandidategeneGRMZM2G351454isconfirmedbygerminalrevertant.SotheDsinsertionofGRMZM2G351454isthecausationoftheShu00067mutant.TheGRMZM2G351454belongstotheAccumulationofPhotosystemOne(APO)family,andhasthehighestsimilaritywithAPO3ofArabidopsis.SotheGRMZM2G351454isnamedasZmAPO3.ThetranscriptofZmAPO3isnotdetectedinthezmapo3mutantbyRT-PCRandthetheZmAPO3proteinisalsonotdetectedinthezmapo3mutant.Theseresultsindicatethatthezmapo3mutantisanullmutant.TheAPOfamilyincludesfourmembersAPO1toAPO4inArabidopsis,riceandmaize.BoththeAPO1andAPO2arelocalizedinchloroplasts,APO3andAPO4werepredictedtolocalizeinmitochondria.Inthisstudy,theZmAPO3isconfirmedtolocalizeinmitochondriabythetransientexpressionusingthefusionproteinofZmAPO3andCFPinonionepidermalcells.IthasbeenreportedthatZmAPO1participatesinthesplicingofseveraltypeIIintronsinchloroplasts.Sothat,alltheintronsofmitochondrialgenesofmaizearedetectedusingRT-PCRbetweentheimmaturekernelsofwildtypeandapo3mutant.Onlynad7intron3iscompletelyunsplicedinthemutant.NAD7Proteinisnotdetectedintheapo3mutantbywesternblotting.Inapo3mutant,themitochondrialcomplexIandsupercomplexI+III2wasfoundmissingusingBN-PAGEandactivestaining.TheresultofRNAEMSAshowsthatZmAPO3isRNA-bindingproteinandisrequiredforthesplicingofnad7int3.ZmAPO3foundinthisstudyisthefirstfactorparticipatinginthesplicingoftheintronsofmitochondriaencodinggeneinzeamays,anditisalsothefirstfactorinvolvedinthesplicingofnad7int3.ThisstudymakesasupportforthepreviousreportsthatthenormalfunctionofmitochondrialcomplexIisimportanttothedevelopmentofseedincereal.APOfamilyisasmallgenefamilywhichonlyincludesfourmembers.Sofar,APO1andAPO3hasbeenrespectivelyprovedtobeinvolvedintheintronsplicingofgenesencodedbychloroplastsandmitochondria,andthisstudyprovidesimportantcluestoinvestigatethathowthiskindofproteintakepartinthesplicingofintronsofgenesencodedbychloroplastsandmitochondriaandtheformationofthesplicesomes.Keywords:maize;Ds;dekMutant;APO3gene;nad7gene;NADH:ubiquinoneoxidoreductase1.1玉米种子胚乳的发育玉米是全球第一大作物，是重要的粮食和饲料作物，也是重要的工业原料。玉米籽粒是最重要的储藏器官，是玉米产量的直接决定者。玉米的籽粒主要包括种皮，胚和胚乳。胚乳中积累了大量的淀粉和储藏蛋白，占玉米籽粒干重的90%，因此玉米胚乳的正常发育决定了玉米的产量和品质。所以对于玉米籽粒和胚乳发育的研究一直都是玉米研究中的重点和热点。1.1.1胚乳的来源、结构与发育胚乳最初来源于双受精。在谷物中，一个精子与卵细胞结合形成二倍体的受精卵最终发育为胚，另外一个精子与中央细胞结合成三倍体的受精极核最终发育为胚乳[1]。双受精之后，受精极核很快就进入了核分裂期，此时的成膜体功能受到抑制，不形成细胞膜，直到形成由微管蛋白构成的细胞骨架为依托的多细胞核的大细胞称为合胞体就完成了中央细胞的细胞周期。合胞体再经放射状的微管体系形成蜂窝状的细胞小室，这个过程大约在授粉后第四天（4DAP）完成。在合胞体细胞化之后，中央细胞有丝分裂的抑制被解除，便开始了活跃的有丝分裂期。有丝分裂高峰期大约处在授粉后8-10天（8-10DAP）。有丝分裂阶段决定了胚乳最终的细胞数量多少，对最终的总产量具有较大影响，但其多少也受外层细胞层的影响，如糊粉层。玉米胚乳发育