文献阅读从小鼠胚胎和成年纤维细胞培养多功能干细胞的诱导由因子决定

文献阅读——从小鼠胚胎和成年纤维细胞培养多功能干细胞的诱导由因子决定原作者：KazutoshiTakahashi（高桥俊）ShinyaYamanaka（山中伸弥）发表于：CellVolume126,Issue4,25August2006,Pages663–676一研究介绍：分化的细胞可以通过核转移到卵母细胞，或者通过胚胎干细胞被重新编程到胚胎形态。原作者证明了从小鼠胚胎或成纤维细胞培养诱导多功能干细胞是通过引入4个因子，即Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4决定。指定的iPS（诱导的多功能干细胞）细胞，能显示出ES细胞的形态和生长特性，以及表达ES细胞标记基因。皮下移植iPS细胞到裸鼠会造成含有多种来自三个胚层组织的肿瘤。这些数据表明，多功能干细胞可以直接从通过加入几个决定因子到成纤维细胞培养物中获得。胚胎干细胞具有无限增值的能力，并且同时保持着多功能性以及分化成三个胚层的能力，所以它可以用来治疗某些疾病。为了规避伦理问题，因此从患者自身的细胞中提取多功能干细胞。未受精的卵子和胚胎干细胞中具有赋予体细胞全能性的因子。研究调查了几个转录因子，得出通过组合选定的因素能够产生多功能干细胞。二论文选题与分析：研究人员把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。这证明了细胞的分化不是单向的。也许最终能够实现直接从病人体细胞中获得多能性细胞的建立。为减少器官移植的免疫排斥反应的解决提供了可能途径。其研究过程中开发的检测筛选干细胞的系统也为实验研究提供了新的检测方法三研究思路与技巧：原作者设计了几个实验，并且得到了如下现象与结果：（1）、选定了24个候选基因，通过对G418的抗性检测。将24个候选基因导入小鼠胚胎成纤维细胞中（MEF）感染Fxr。结果表明没有一个单一的候选基因能激活Fbx基因座。但是，24个候选基因共同转录却产生了22个抗G418抗性菌落。并且，数据表明，这24个候选基因的某些组合能诱导在MEF培养的ES标记基因的表达。通过对G418抗性菌落的研究，确定了10个因子。结果表明，Oct3/4，Klf4，Sox2和c-Myc在MEF培养产生iPS细胞过程中发挥至关重要的作用。这四个基因组合的效果类似于10个因子组合。有关数据表明，可以通过导入这四种因子来从MEF中诱导iPS细胞。两个因子的组合不能诱导G418抗性菌落，3个因子虽然可以产生，但是不能保持。数据表明，Oct3/4和c-Myc以及Klf4的组合可以激活Fbx的基因座，但是这三个单独因子在iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞中变化是不同的。总之结果表明，Oct3/4，Klf4，Sox2和c-Myc在MEF培养产生iPS细胞过程中发挥至关重要的作用。（2）、进行了RT-PCR研究ES细胞的标记基因是否在iPS细胞中表达。几种标记基因，包括Oct3/4，在iPS-MEF4-7，iPS-MEF10-6，和iPS-MEF10-7克隆高于其余细胞。Sox2仅在iPS-MEF10-6表达。染色质免疫分析表明，Oct3/4和Nanog增加了组蛋白H3的乙酰化和减少组蛋白H3。其他相关数据也表明，对于ES细胞iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞相似，但不完全相同。在IPS-MEF3克隆中，ECAT1，ESG1和Sox2没有被激活。Nanog虽然能被诱导，但程度小于在iPS-MEF4和iPS-MEF10克隆等这些数据表明IPS-MEF3与iPS-MEF4和iPS-MEF10不同。原作者利用DNA微距阵比较了胚胎干细胞，ES细胞的全局基因图谱和Fbx15βgeo/βgeo。结果表明iPS细胞相似但不相同。（3）、通过畸胎瘤的形成，研究iPS细胞的多能性。组织学检查显示，2iPS-MEF10克隆，2iPS-MEF4克隆（2,7），以及iPS-MEF4wt-4克隆能分化成三种胚层，包括神经组织，软骨和柱状上皮。但是这些畸胎瘤不表达滋养层标记CDX2。iPS-MEF10-1肿瘤分化成外胚层和内胚层，但在从剩余的iPS-MEF10没有中胚层分化的迹象。这些数据表明，大多数，但不是所有的iPS-MEF10和iPS-MEF4克隆表现出多能性。与此相反，由iPS-MEF3克隆衍生的所有肿瘤由完全未分化的细胞组成。因此，虽然这三个因素（的Oct3/4和c-Myc和Klf4的）可诱导一些ES细胞标记基因的表达，但它们不能够诱导多能性。当在组织培养皿生长，iPS-MEF10和iPS-MEF4细胞的胚状体附着在培养皿底部并开始分化。3天后，免疫染色检测到的阳性细胞α平滑肌肌动蛋白（中胚层标记物），α甲胎蛋白（内胚层标记物），和βIII微管蛋白（外胚层标记物）（图5D）。与此相反，由iPS-MEF3细胞胚状体保持未分化。这些数据证实的iPS-MEF10和iPS-MEF4体外多能性和iPSMEF3无能性（4）、将4个选定因子移植到7周龄雄性尖尾成纤维细胞的Fbx15βgeo/βgeo。我们得到的3G418抗性集落，从每一个抗性集落我们都可以建立iPS细胞。此外原作者建立了另一个Ips-TTFffp4.其中，用于四个因子的cDNA在转基因的两个loxP位点两端。RT-PCR检测表明Ips-TTFffp4wt细胞还表达大部分ES细胞1标记基因。原作者移植2Ips-TTF4和6Ips-TTFffp4克隆物到裸鼠，所以这些都将产生3胚层。然后将iPS-TTFgfp4细胞的两个克隆通过显微注射导入了C57/BL6囊胚中。用Ips-TTFgfp4-3，获得了13.5天的18个胚胎，其中的两个展示了有GFP-阳性的iPS细胞存在。组织学分析确认iPS细胞贡献于所有的三胚层。在生殖腺中观察到GFP-阳性细胞但是不能确定他们是生殖细胞还是体细胞。用iPS-TTFgfp4-7，我们获得了7.5天的2个胚胎，其中的3个是GFP阳性的。此外，iPS-TTFgfp4细胞能在体外分化成三胚层。这些数据表明四个筛选因子能诱导成体小鼠成纤维细胞产生多能性细胞。（5）、进一步检测了在iPS细胞中四个因子和其他因子的表达。Real-timePCR显示iPS细胞中Oct4和Sox2的内源性表达水平比ES细胞低。然而，内源基因和转基因中四因子的总体的量超过了ES细胞中正常的表达量。作为对照，Westernblot分析显示在iPS细胞中四个因子的总蛋白量于ES细胞中的那些进行对比。以在iPS细胞中检测到Nanog和E-Ras的蛋白质，但是比ES细胞的低。Southernblot分析显示每个iPS克隆有一个独特的转基因整合机制。IPS-TTFgfp4和iPS-TTFgfp4wt克隆的核型分析显示2个iPS-TTFgfp4的克隆和所有的iPS-TTFgfp4wt克隆展现了一个正常的40XX的核型，然而其他的3个iPS-TTFgfp4的克隆是39XO，40XO+10和40Xi（X）。最终，原作者发现了iPS细胞在培养基缺少饲养层细胞，甚至缺少LIF时不能够保持未分化。这些结果，与不同的基因表达模式，排除了iPS细胞仅仅是预成ES细胞的污染的可能性。最终，iPS细胞的亚克隆是碱性磷酸酶检验阳性而且在体外能够分化出三胚层，证实了它们无性繁殖的本质。讨论Oct4，Sox2和Nanog有着维持多能性的核心转录因子的功能。Oct4和Sox2对于产生iPS细胞是必要的，但Nanog是非必要的。除此之外，原作者鉴定了c-Myc和Klf4作为核心因子。这两个与肿瘤相关的因子，不能被包括E-Ras,Tcl1,β-catenin,和Stat3在内的其他癌基因代替。c-Myc蛋白质有许多增强增值和转化的下游区靶位点。C-Myc蛋白质可能诱导全面的组蛋白乙酰化作用，因此允许Oct4和Sox2结合到它们的特殊靶器官。Klf4能直接抑制p53，p53能在ES细胞分化的过程中抑制Nanog基因。Klf4可能通过抑制p53蛋白来活化Nanog和其他ES细胞特化因子。Klf4可能通过抑制p53蛋白作为Myc诱导的细胞凋亡的抑制剂，Klf4通过活化了p21，从而抑制细胞增殖。这种平衡可能对于iPS细胞的产生非常重要。关于iPS细胞的起源的问题，只有表达四因子细胞中的一小部分成为了iPS细胞。有研究表明大约0.067%的小鼠皮肤细胞是干细胞。四个因子从浓缩的间质干细胞和其他多能性细胞的骨髓间充质诱导iPS也是同等的低效率。实验结果没有显示多能的组织干细胞是iPS细胞的起源。造成得到iPS细胞的低概率的可能性有是只有一小部分正确表达四因子级别的细胞能够获得像ES细胞一样的特性。关于四因子是否在被结合的ES细胞或核移植进入卵母细胞诱导的重编程中起到了作用依然不能完全确定。iPS细胞不等同于ES细胞，就像已经在全部基因表达机制和DNA甲基化状态显示的一样。有可能原作者错过了额外的重要的因子。更难了解的是四因子，特别是Klf4和c-Myc，在观察卵母细胞重编程中的作用。作者的实验展示了iPS细胞能够在体外和体内甚至在包含四因子的逆转录病毒载体的条件下分化。并且在体外分化的过程中Oct4和Sox2蛋白质下降明显。逆转录病毒的表达已经表明在ES细胞中被支持，而且会进一步通过后天修饰比如DNA甲基化而分化沉默。四论文的发展方向：原作者证明了从小鼠胚胎或成纤维细胞培养诱导多功能干细胞是通过引入4个因子，即Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4决定。指定的iPS（诱导的多功能干细胞）细胞，能显示出ES细胞的形态和生长特性，以及表达ES细胞标记基因。这项研究在现实生活中也有广泛的应用。研究发现了其他ES细胞标记基因的转基因报告基因，比如能够在筛选中替代Fbx15的敲入的Nanog基因。但是，并不知道四个因子是否可以人体细胞中得到多能性细胞。所以C-Myc的利用可能不适合临床应用，而且这个过程需要特殊的培养环境。但是在控制细胞多能性这方面，希望能够实现直接从病人体细胞中获得多能性细胞的建立。目前胚胎干细胞研究面临伦理争议及来源困难等诸多问题,人们一直在寻找不需破坏胚胎或卵细胞的建立多潜能干细胞的方法。与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术相比，iPS技术不没有伦理学的问题。并且iPS技术用病人自己的体细胞诱导出干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。iPS干细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。iPS干细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面也将会起重要作用。并且可以定制特定病人来源的iPS干细胞来治疗疾病。但是，目前在临床应用上还有一定的困难，因为在添加和取代疾病细胞中缺陷基因时可能有导致癌症的副作用。附录