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文献综述蛋白多级结构的表征及测定方式摘要研究蛋白质的结构对生命科学有重要意义，因为明确了蛋白质的结构，有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质(或其它分子)之间的相互作用，这无论是对于生物学还是对于生物医学和生物药学，都是非常重要的。蛋白质分子的多级结构可划分为四级，以描述其不同的方面，包括蛋白二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构。关键词：二级结构超二级结构和结构域三级结构四级结构表征和测定方式1蛋白多级结构概述蛋白质分子是由氨基酸首尾相连缩合而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象，即蛋白质的结构。1.1蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构（secondarystructure）是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。蛋白质主链构象的结构单元包括：α-螺旋（α－helix）、β-片层结构（β－pleatedsheet）或称β-折迭、β-转角（β－turn或β－bend）、无规卷曲（randomcoil）。α-螺旋有以下几个特点：①多个肽键平面通过α－碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。②主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。③每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C=O之间形成氢键。④肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。β-片层结构有以下几个特点：①是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。②依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C=O与H形成氢键，使构象稳定。③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。β-片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。④平行的β-片层结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的β-片层结构，则间距为0.7nm。β-转角结构的特点：蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是β-转角。无规卷曲的特点：没有确定规律性的部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列。图1蛋白质的二级结构1.2蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构（supersecondarystructure）是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。目前发现的超二级结构有三种基本形式：α螺旋组合（αα）；β折叠组合（βββ）和α螺旋β折叠组合（βαβ），其中以βαβ组合最为常见。结构域（domain）也是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。一般每个结构域约由100-200个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。蛋白质的三维空间结构与其功能紧密相关，而超二级结构正是构成三维结构的基本单元。从蛋白质一级结构直接预测三维空间结构非常困难，蛋白质二级结构及超二级结构正是两者直接之间的重要桥梁，因此超二级结构的预测有着重要的研究意义。图2蛋白质的超二级结构图3结构域1.3蛋白质的三级结构蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构（tertiarystructure）。现也有人认为蛋白质的三级结构是指蛋白质分子主链折叠盘曲形成构象的基础上，分子中的各个侧链所形成一定的构象。侧链构象主要是形成微区（或称结构域）。蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力等。这些次级键可存在于一级结构序号相隔很远的氨基酸残基的R基团之间，因此蛋白质的三级结构主要指氨基酸残基的侧链间的结合。图4蛋白质的三级结构1.4蛋白质的四级结构具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为蛋白质的四级结构（quarternarystructure）。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基（subunit）。四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。图5蛋白质的四级结构2蛋白多级结构的测定方式2.1蛋白质二级结构的测定方式蛋白质的二级结构在在维持蛋白质的生理活性的过程中发挥着十分重要的作用。近年来，国内外学者利用各种物理和化学方法对其做了大量的工作。目前，常用的蛋白质二级结构检测方法有X-射线晶体衍射、核磁共振光谱、圆二色光谱、紫外光谱、荧光光谱与红外光谱等[1]。这些方法各有其优缺点。2.1.1X-射线晶体衍射法X-射线晶体衍射[2]是确定蛋白质构象最准确的方法。虽然其能够提供完整的蛋白质晶体结构信息，但它要求高质量的单晶样品，对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难。同时，对于某种特定的蛋白来说，结晶过程有可能改变蛋白质的结构，使得两种状态下蛋白质的结构不完全相同。而且，它只是反映蛋白质的一种静态结构，不能用于测定蛋白质的溶液构象，不容易说明大分子在生理状态下结构与功能的关系。另外其实验过程复杂、所用时间长也是该技术的不足之处。马礼敦[3]在文章中却提到X-射线晶体衍射在测定HIV病毒及多种有关蛋白的结构中的应用及其广泛。1989年已测出HIV-1蛋白酶的晶体结构，属天冬氨酸蛋白酶族，图6左为其带状结构图。是由2个99个氨基酸肽链构成的二聚体，呈C2对称，并找到每个单体上有一个天冬氨酸活性点。图6右图为HIV-1蛋白酶局部的原子结构图，画出了它与抑制剂A-74704的氢键结合模式，上中部的叉形分子即为抑制剂。图6左的上部空穴中的蓝色分子也为抑制剂分子。图6（左）HIV-1蛋白酶的晶体结构与抑制剂；（右）抑制剂与A-74704与HIV-1蛋白酶之间的氢键结合模式2.1.2核磁共振光谱法核磁共振法常规应用于解析化学物质结构和反应性能，尤其是在确定溶液中蛋白和多肽结构方面起着其它物理分析方法不可比拟的作用。张猛[4]等人在文章中综述了核Overhauser效应(NOE)等确定蛋白或多肽二级结构的方法。NMR方法可以在很宽的时间尺度上进行蛋白质动力学的研究。针对大分子量蛋白和信号灵敏度较低的情况下，可以釆用固体核磁共振和位点特异性氨基酸标记的方法进行蛋白质结构、功能和动力学的研究。石攀[5]在文章中介绍了目前用于核磁共振研究的非天然氨基酸的种类和标记方法，分别介绍了液体和固体核磁在非天然氨基酸标记研究中的应用。2.1.3圆二色光谱法毛晓英[6]在文章中采用远紫外圆二色光谱来表征核桃蛋白碱溶酸沉的制备过程中二级结构的变化。图7核桃蛋白样品的远紫外CD图谱(a核桃脱脂粉；b核桃分离蛋白；c核桃浓缩蛋白)如图7所示，核桃分离蛋白和浓缩蛋白与核桃脱脂粉的CD图谱负峰峰形基本一致。核桃脱脂粉具有典型的α-螺旋结构的谱图，在201nm和221nm有2个负的肩峰谱带。核桃分离蛋白在204nm和229nm有负肩峰。其负峰位发生了红移。核桃浓缩蛋白在199nm和221nm有2个负的肩峰谱带。表1远紫外CD测定核桃蛋白样品的二级结构a通过软件分析二级结构数据(见表1)可知，核桃脱脂粉主要以α-螺旋结构为主，占80.4%。核桃分离蛋白和浓缩蛋白的二级结构含量比较相似，主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，分别占35%，32%，其中β-折叠结构有所增加。由此结果可以看出，核桃蛋白包含了α-螺旋，β-折叠，β-转角，无规则卷曲等4种类型的二级结构，其中以α-螺旋和无规则卷曲较多。核桃分离蛋白和浓缩蛋白在制备过程中改变了核桃蛋白质的二级结构，其中，在一定程度上破坏了α-螺旋结构，使β-折叠少量增加，同时无规则卷曲和β-转角结构明显增加。王铮[7]等人利用圆二色光谱检测蛋白质并对蛋白的二级结构进行分析、计算，可以得到对蛋白二级结构影响的各种因素和结果。对不同蛋白二级结构的圆二色检测结果表明，在检测过程合适的蛋白浓度对结果的稳定性有非常重要的用，对于抗体蛋白来说，浓度为10~50μg/ml的区间内，计算得到的二级结构比例是基本稳定的，超出该范围，计算结果偏差加大。图8不同浓度血清白蛋内的圆二色光谱测量结果如图8所示，为不同浓度血清白蛋内的圆二色光谱测量结果。图9不同浓度的模型蛋白圆二色光谱图对不同浓度的模型蛋白圆二色光谱图进行二级结构计算结果如表2所示，从表2可以看出，浓度介于10~100μg/ml时，计算出的蛋白的二级结构波动小。表2不同浓度模型蛋白的二级结构计算表对浓度范围1~500μg/ml的模型蛋白进行圆二色扫描，并对得到的谱图进行二级结构计算，结果表明，在蛋白浓度介于10~100μg/ml之间时，谱图光滑，里然圆二色光谱图的强度有变化，但是峰形相似，计算出的蛋白的二级结构波动小，接近预测值。浓度过大、过小时二级结构计算结果变化较大，拟合因子大，和预测结构偏离大。2.1.4傅里叶红外光谱法傅里叶红外光谱法FTIR是近20年来才兴起的新的光谱学技术，与传统的色散型红外光谱仪相比有其独特之处。FTIR属于分子振动吸收光谱，是化合物鉴定和结构分析的常用手段。其独特之处，就在于可以测定不同状态、不同浓度及不同环境中的蛋白质和多肽。因此它是目前研究蛋白质及多肽结构与功能关系强有力的主要手段之一[8]。戈志成[9]等人采用FTIR法对改性小麦面筋蛋白的二级结构进行了测定。实验内容主要采用该法(FTIR）对湿热-琥珀酸酐酰化改性谷阮粉进行结构分析。结果显示：谷朊粉的二级结构是以β-折叠结构为主，改性后的谷朊粉二级结构有明显变化，琥珀酸酐处理会使部分β-转角结构转化为β-折叠结构，并且使α-螺旋结构减少。下图是将样品用研钵研磨成均匀粉末，压制成薄片，再用红外光谱仪做全波段扫描(400-4000cm-1)，扫描次数128次。图10(1)谷朊粉(2)湿热-酰化处理谷朊粉(3)湿热谷朊粉(4)酰化处理谷朊粉图10中(1)-(4)样品分别为原料谷朊粉、湿热-酰化处理谷朊粉、湿热谷朊粉、酰化处理谷朊粉。经过湿热处理的谷朊粉结构变化比较小，仅有少量的β-转角结构转化为β-折叠。经过单独琥珀酸酐处理的谷朊粉β-折叠的结构有大幅度的增加，而β-转角α-螺旋结构含量明显减少。而经过湿热-琥珀酸酐酰化的谷朊粉的α-螺旋结构变化不大，而β-折叠有所增加β-转角相应减少，但是β-折叠增加幅度并没有单独琥珀酸酐处理的谷朊粉的变化幅度大。拉曼光谱(Raman)、核磁共振谱（NMR)、圆二色谱(CD)、红外光谱(IR)等方法都先后用来研究蚕丝及丝蛋白的构象及其转变机制[10]。其中，傅立叶变换红外光谱(Fouriertransforminfrared，FTIR)是最常用的手段之一，它是对连续光源干涉图进行傅立叶逆变换所得光谱。傅立叶红外光谱凭借其对物质分子结构的灵敏性而广泛应用于蛋白质二级结构和构象转变的研究中。在丝蛋白的中红外光谱中，呈现酞胺I至酞胺v区域的特征吸收峰，使其能够对丝蛋白的构象，即无规线团、α-螺旋(α-helix)和β-折叠β-sheet)等，进行强有力的表征。莫春丽[11]在对再生丝蛋白二级结构的表征研究中就采用的是傅里叶红外光谱法。测定结果如下：实验主要采用再生丝蛋白水溶液(Regeneratedsilkfibroin，RSF)来制备丝蛋白膜样品。实验中制备了四种样品并将其命名：RSF-200-25为25℃下浇铸的厚度约为200μm的厚膜；RSF-200-60为60℃下浇铸的厚度约为200μm的厚膜；RSF-10-25为25℃下浇铸的厚度约为10μm的薄膜，RSF-10-25-M代表RSF-10-25经过70%甲醇(Methanol)水溶液浸泡lh。试验中采用NieoletNexus470FTIR光谱仪对该四种样品近红外透射测试。波谱范围为4000-11000cm-1，光谱分辨率为4cm-1，每条谱线由128次扫描叠加。图11为我们制备的四种样品的OMNI采样