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课程设计报告设计课题柿叶总皂苷的提取工艺研究学生姓名：王日标学号：110303130专业班级：生物技术111指导教师：林国荣环境与生命科学系制2014年11月目录1.设计目的与要求-----------------------------------32.设计正文--------------------------------------------33.设计总结--------------------------------------------83柿叶总皂苷的提取工艺研究1设计目的与要求1.1目的柿叶为柿树科(Ebenaceae)柿树属(Diospyros)植物柿(DiospyroskakiL.f.)的新鲜或干燥叶。全世界柿树有6属450余种，其中我国有2属50多种。我国是世界上最主要的柿树生产国，占世界总产量的50%以上。柿叶具有较高的营养价值和医疗保健作用，柿叶含有丰富的维C、芦丁、胆碱、黄酮苷、胡萝卜素、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体健康有益的营养成分；据测定，每百克柿叶中含有蛋白质11.05g、脂肪6.84g、糖类54.84mg、维C704mg、胆碱317mg、芦丁121.34mg，其中尤以维生素C含量为多，比一般水果高几倍到几十倍[1]。柿叶具有抗菌消炎、生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种医疗保健功能[2]。柿叶中含有黄酮类、皂苷类、香豆素类、多糖等多种化学成分。其中皂苷广泛分布于自然界，主要包括三萜皂苷和甾体皂苷两种。其中，三萜皂苷在豆科、五加科、葫芦科、毛茛科、石竹科、伞形科、鼠李科、报春花科等植物分布较多。而甾体皂苷主要分布在薯蓣科、百合科、玄参科、菝葜科、龙舌兰科植物中。柿叶中含有多种三萜类化合物；从柿叶中分离鉴定的三萜类化合物有乌苏醇、乌苏酸、齐墩果酸、白桦脂酸、19α-羟基乌苏酸、19α，2、4-二羟基乌苏酸、熊果苷等[3]。皂苷是一类较复杂的苷类化合物，与水混合振摇时产生持久性的似肥皂泡沫状物。由于皂苷具有多种多样的生理活性和药理作用。如降血脂，抗衰老，增强机体免疫力，消炎、抗病毒、抗肿瘤抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇和免疫调节等功能。因此，皂苷的分离提取目前成为人们研究的热点之一。由于皂苷提取物往往被认为有效成分含量低、杂质多、质量不稳定，用药多建立在经验的基础上，难以与现代医学接轨。为解决这个问题，研究并优化皂苷的分离与纯化工艺十分必要。1.2要求做本次试验的学生应具备有机化学及实验、现代生物学基础及实验、植物生理学及实验、生物化学及实验、生化工程、仪器分析以及生物技术实验等基础知识和专业知识。在实验过程中使用单因素试验法和正交试验法进行实验；并最终得出最佳提取柿叶总皂苷的条件进行提取柿叶中的总皂苷，并在OD580nm下测定其吸光值。2单因素试验在我们对柿叶总皂苷的提取工艺进行研究时，同样也借鉴了诸多前人的经验。周跃华等[4]采用色谱法对麦冬总皂苷进行提取；主要对溶媒（水、乙醇）进行比较；还有对麦冬总皂苷提取的影响因素，主要有提取次数、药材粒度等进行比较；得出最佳提取条件为用5～10目的药材，提取3次，每次1h，4基本能提尽麦冬皂苷。我们的课程设计为《柿叶总皂苷的提取工艺研究》，主要采用单因素试验，考察超声波辅助提取、水和乙醇提取对柿叶中总皂苷提取率的影响；同时采用正交设计试验，考察固液比、提取温度、提取时间和乙醇浓度对柿叶中总皂苷提取率的影响。2.1超声波辅助提取对柿叶总皂苷提取的影响首先我们对超声波辅助提取进行单因素试验；在相同浸提时间、浸提温度和固液比，不同超声波辅助处理时间的条件下对柿叶总皂苷进行提取并过滤得出滤液（浸提时间为：18min，浸提温度为：80℃，固液比为：1：10）。将过滤取得的滤液以1：10的比例进行稀释，并将稀释后的溶液在OD580nm下测定其吸光值，最终的结果为：表1：不同超声波辅助提取时间中柿叶总皂苷提取的吸光值超声时间（min）0369121518吸光度（A）OD=580nm0.4670.5520.5570.6120.6520.5260.5070.4660.5510.5580.6100.6520.5270.5070.4660.5490.5580.6110.6530.5270.508均值（A）0.4660.5510.5580.6110.6520.5270.507在浸提时间为：18min，浸提温度为：80℃，固液比为：1：10的固定条件下，超声波辅助处理所得，由表1可见用超声波辅助12min吸光值最大，浸提效果最好，超过此值后呈递减趋势，可能是超声波机械作用和空化作用提高的柿叶细胞皂苷浸出率，随着作用时间的延长其机械作用使部分皂苷的结构破坏而损失。我们得出的最终得出结论为超声波处理的时间应该在12min时为最佳超声波处理时间。2.2固液比对柿叶总皂苷提取的影响在相同浸提时间、浸提温度的条件下对不同固液比进行单因素试验（浸提时间：90min，浸提温度：60℃)，测定其对柿叶总皂苷提取的影响。浸提完成后将浸提液进行过滤，最后将取得的滤液以1：10的比例进行稀释；稀释过后将稀释的溶液在OD580nm下测定其吸光值，最终的结果为：表2：不同固液比中柿叶总皂苷提取的吸光值固液比1：61：81：101：121：151：181：20吸光度（A）OD=580nm0.9460.9480.7510.3400.3670.3960.6660.9420.9490.7520.3410.3660.3950.6660.9450.9480.7510.3410.3660.3960.666均值（A）0.9440.9480.7510.3410.3660.3960.6665在浸提时间：90min，浸提温度：60℃的固定条件下，由表2可见在固液比1：6、1:8、1:10的条件下吸光值较大，浸提效果较好，其后随固液比增加吸光值都比其小，可能是固液比太大在一定皂苷含量的前提下提取液浓度越低所致。2.3浸提温度对柿叶总皂苷提取的影响在相同固液比、浸提温度的条件下对不同浸提温度进行单因素试验（浸提时间：20min，固液比：1：10)，测定其对柿叶总皂苷提取的影响。浸提完成后将浸提液进行过滤，最后将取得的滤液以1：20的比例进行稀释；稀释过后将稀释的溶液在OD580nm下测定其吸光值，最终的结果为：表3：不同浸提温度中柿叶总皂苷提取的吸光值浸提温度（℃）405060708090吸光度（A）OD=580nm0.3940.5100.5210.7180.6300.5220.3930.5500.5220.7150.6300.5190.3950.5490.5220.7150.6300.519均值（A）0.3940.5500.5220.7160.6300.520在浸提时间：20min，固液比：1：10的固定条件下，由表3可见在温度为50、70、80℃时吸光值较大，浸提效果较好，超过70℃有下降趋势，可能是温度过高时反倒破坏了部分皂苷结构致损失。因此得出柿叶总皂苷提取的较佳浸提温度为50、70、80℃。2.4浸提时间对柿叶总皂苷提取的影响在相同固液比、浸提温度的条件下对不同浸提时间进行单因素试验（浸提温度：60℃，固液比：1：10)，测定其对柿叶总皂苷提取的影响。浸提完成后将浸提液进行过滤，最后将取得的滤液以1：10的比例进行稀释；稀释过后将稀释的溶液在OD580nm下测定其吸光值，最终的结果为：表4：不同浸提时间中柿叶总皂苷提取的吸光值超声时间（min）405060708090吸光度（A）OD=580nm0.4150.5450.6910.6000.6400.7650.4140.5460.6900.6030.6440.7640.4140.5450.6900.6030.6410.765均值（A）0.4140.5450.6900.6020.6420.756在浸提温度：60℃，固液比：1：10的固定条件下，由表4可见在浸提60、80、90min吸光值较大，浸提效果较好，可能是在皂苷含量一定前提下随着浸提时间的增加，浸提量已达稳定所致。因而6得柿叶总皂苷提取的最佳浸提时间为60、80、90min。2.5乙醇浓度对柿叶总皂苷提取的影响在相同固液比、浸提温度、浸提时间的条件下对不同乙醇浓度进行单因素试验（浸提温度：60℃，浸提时间：10min，固液比：1：10)，测定其对柿叶总皂苷提取的影响。浸提完成后将浸提液进行过滤，最后将取得的滤液以1：10的比例进行稀释；稀释过后将稀释的溶液在OD580nm下测定其吸光值，最终的结果为：表5：不同乙醇浓度中柿叶总皂苷提取的吸光值醇浓度（％）2030405060吸光度（A）OD=580nm0.4660.6500.7960.8710.6430.4670.6510.7970.8690.6420.4670.6520.7960.8710.643均值（A）0.4670.6510.7960.8700.643在浸提温度：60℃，浸提时间：10min，固液比：1：10的固定条件下，由表5可见在醇浓度40、50、60%时吸光值较大，浸提效果较好，超过50%时有下降趋势，可能是醇浓度过高时提取液易挥发所致。通过我们所做的试验最终得出柿叶总皂苷提取的乙醇浓度应以40%、50%、60%为佳。3正交试验在上述的过程中我们利用单因素试验法对超声波辅助时间、浸提温度、浸提时间、固液比和乙醇浓度进行实验，最终得出了各个最佳的超声波辅助时间：12min、浸提时间：90min、浸提温度：70℃、固液比：1：8和乙醇浓度：50%；但是实验中还有综合性的因素和各种不同的实验误差；所以我们利用不同的浸提温度、浸提时间、固液比和乙醇浓度进行正交试验，并得出最佳的、提取率最高的柿叶总皂苷的提取工艺条件。为了综合考虑多因素对提取过程的影响，采用三水平四因素正交试验对提取过程进行研究。根据单因素试验结果确定各因素的合理水平。按照L9(34)正交表设计的试验方案、极差、优水平和结果进行分析。表6：正交试验中不同编号柿叶总皂苷提取的吸光值编号123456789吸光值（A）OD580nm0.5700.4960.5090.6940.4620.6940.5340.9470.7250.5710.4950.5090.6940.4600.6950.5320.9470.7240.5710.4940.5090.6950.4620.6950.5320.9470.725均值（A）0.5710.4950.5090.6940.4610.6950.5330.9470.7257表7：柿叶总皂苷提取的影响因素的正交试验表L9(34)试验编号ABCD吸光度OD=580nm浸提温度(℃)浸提时间（min）固液比醇浓度（％）140601：6300.571240801：8400.495340901：10500.509460601：8500.694560801：10300.461660901：6400.695780601：10400.533880801：6500.947980901：8300.752指标之和∑K11.5751.7892.2131.784总和T=22.619∑K21.8501.9031.9411.723∑K32.2321.9561.5032.150平均值K1’0.5250.5960.7380.595平均值之和T=7.540K2’0.6170.6340.6470.574K3’0.7440.6520.5010.717极差（R）0.2190.0560.2370.143—优水平A3B3C1D3—因素主次顺序2413—由表7实验结果可知，柿叶总皂苷的最佳提取工艺为：提取温度：80℃；固液比：1：6；乙醇浓度50%；提取时间90min；各种因素对提取效果影响的主次顺序依次为：固液比浸提温度乙醇浓度提取时间。通过方差分析检验可知，四种因素对提取率均有影响，提取温度、固液比、溶剂浓度对总皂苷的提取影响非常显著，提取时间对总皂苷含量的影响比较不明显。通过查阅资料，钟先锋等[5]通过单因素和正交试验确定了山药总皂苷的最佳提取工艺条件为：浸提温6O℃，乙醇体积分数