农杆菌感受态的制备方法

1农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚：1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml利福平的LB（千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。第三天下午或晚：2)挑取单菌落接种于灭菌的50ml新管子加10ml50μg/ml（千分之一）利福平的LB液体培养基中，200rpm28℃振荡培养12-16hr（过夜可以）。注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。第四天早：3)取1-2ml（按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml（千分之一）利福平的100mlLB液体培养基中（用500ml的三角瓶来摇菌28℃，200rpm振荡培养至OD600=0.5）。注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50ml管子的菌液。摇菌的过程中可以预先把NaCl置于冰上预冷。4)转移菌液到新的灭过菌的50ml离心管中，冰上30min；5)4℃，5000rpm离心5min。6)在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl快速冲洗一遍。7)加入10ml预冷的0.15M的NaCl溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。注意：要用5ml枪调到3ml挡，轻轻抽打。8)4℃，5000rpm离心5min。9)在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。10）加入2ml预冷的含15%甘油的20mM的CaCl2溶液，轻轻悬浮。注意：要用1ml枪轻轻抽打。11）按200ul的量分装到1.5ml无菌Eppendorftube中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。2准备工作：１）器材刷洗及准备：准备至少3个500ml的三角瓶（如果只做2瓶的话，有1瓶要待检测用），1个1000ml的烧杯（用作废液缸），2个100ml的三角瓶（1个装NaCl,1个装CaCl2），蓝枪头、黄枪头各1盒，10个5ml大枪头；12个50ml离心管（新的，没用过的；如果做两瓶，至少要灭8个管子，2个摇菌，6个离心），2盒1.5ml的小管子，半卷吸水纸（叠成小块在培养皿中灭菌），以上物品均需高压灭菌备用。Note:器皿必须刷洗干净，不能残留任何洗涤剂。灭菌时待用器皿内要装水灭菌。2）溶液配制：LB液体培养基300ml;LB固体加千分之一的利福平培养板2个;