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气相色谱质谱联用的原理及应用李自丹2010207449主要内容•1气质联用的原理•2常见的气质联用仪器及色谱柱•3样品处理•4气质联用参数设置•5气质联用对本课题组的意义气质联用的原理•气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。实际为通过样品组份沸点之间的差异先后进柱，然后在气体流动相和固定相之间分配系数的差异进一步分离。•质谱作为气相色谱的检测器，利用电离源将各种成分分子电离成质谱碎片，通过相应的谱库检索碎片信息，给出此信息与某化学物质匹配度，达到对物质进行定性的目的。气质联用组成构建常见的气质联用仪•目前常用的是美国Agilent的和日本岛津的联用仪，其中Agilent为公认的分析测量仪器生产厂家。型号有6890N/5973C、7890N/5975C等6890N/5973C色谱柱•常用的色谱柱包括毛细管柱和填充柱。毛细管柱的参数及选择原则•内径：0.25mm最常用的内径规格。有较高的柱效，负荷量较低，必须分流进样或无分流进样。用于复杂多组份样品分析。•大口径，多固定相大样品容量，分离能力降低，流失较大。•柱长：25—30m中长柱：分离10—50个组份的样品。50m长柱：分离大于50个组份或包含有难分离物质对的复杂样品。•加倍柱长，恒温分析时间则加倍但峰分辨率仅增大40%。如果分析只是比较好但不是特别好的，有比增加柱长度更好的办法来分析结果，如考虑更薄的膜，优化载气流量或用程序升温等。•膜厚：0.25—0.33um标准液厚一般商品柱的标准液膜。对于流出达300℃的大多数样品（包括蜡、甘油三酯、甾族化合物等）能够很好的分析。•毛细管固定液毛细管柱的固定液选择原则---“相似相溶”•a.非极性物质—非极性固定液。沸点越低的组分越早出峰。•b.极性物质—极性固定液。极性越小的组分出越早出峰。•c.极性与非极性混合物—极性固定液。极性越小的组分出越早出峰。•d.易形成氢键物质—极性或氢键型固定液。不易形成氢键的组分先出峰，易形成氢键的组分后出峰。•e.复杂难分离样品—多种固定液混合。常用毛细管柱固定液样品的处理•样品要求溶解在有机溶剂（如丙酮、正己烷、氯仿、苯等）中；溶剂应具有较低的沸点，从而使其容易与样品分离。尽可能避免用水、二氯甲烷和甲醇做溶剂，因为它们对延长色谱柱的使用寿命不利。另外，如果用毛细管柱分析，应注意样品的浓度不要太高，以免造成柱超载，通常样品的浓度为mg/ml级或更低。•样品中不能含有水，盐类等物质；•GC所能直接分离的样品应是可挥发的、且是热稳定的，沸点一般不超过500℃，分子量小于500；•样品含量在ppb-ppm级，样品不得少于20uL；•需要进行衍生化处理的样品，需合理选择衍生化方法。样品的衍生化•衍生化目的：改善待测物质的气相色谱性质、热稳定性、分子质量、质谱行为，引入卤素原子或吸电子基团，通过一些特殊的衍生化方法可以拆分一些难分离的手性化合物。•常用的衍生化方法：•硅烷化衍生化•（1）BSTFA和BTA衍生化胺基和羟基•（2）MTBSTFA常用于药物、类固醇类检测•（3）MSTFA是最常用的硅烷化试剂（苹果酸、富马酸、柠檬酸等）•（4）单糖硅烷化时用一般用三甲基硅烷咪唑（甘露糖、半乳糖、海藻糖等）•酰化衍生化•（1）乙酰化（体内药物筛选，大多数的临床药物）•（2）三氟乙酰化/五氟丙酰化/七氟丁酰化（苯丙胺类和麻黄碱类）•烷基化衍生化（农药和杀虫剂）气质联用参数设置----进样方式•动进样（auto-injector）和手动进样；•自动进样包括填充柱进样口、毛细柱分流/无分流进样口、冷柱头进样、程序升温（PTV）进样口、大体积进样、阀进样。是否分流？•分流（split）主要组分分析；脉冲分流（pulsesplit）允许更大进样量；•不分流（splitless）痕量组分分析；脉冲组分不分流（pulsesplitless）允许更大进样量。•良好的分流比可以防止柱内某些成分含量过高，造成柱超载形成拖尾峰影响分离，使出峰时间相近的成分能够较好的分离。•分流不改变样品浓度，只改变峰的信号强度。•Splitratio(分流比)10:1即为11份，1份进柱子，10份流失。分流进样注意事项•分流进样时为了保证分流比的概念真实有效，样品（溶剂+被分析物）必须与载气充分混合，形成一个均匀的混合物。如果进样量过大，溶剂会膨胀为很大的体积，致使进样口衬管过载。其结果必将导致样品从吹扫出口流出而造成样品损失，同时也会造成载气输入管路的污染。进样（气化）室温度•考虑样品的稳定性？样品是否能够气化？一般在200~250℃•考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间汽化。•进样后要有足够的气化温度，使液体式样迅速气化后被载气带入柱中。在保证样品不分解的情况下，适当提高气化温度对分离及定量有利，尤其当进样量大时更是如此。一般选择气化温度比柱温高30-70℃。色谱柱程序升温条件•程序升温条件是影响样品分离度的最主要因素。根据样品的挥发性等改变；程序升温慢可改善分离效果，但会增加分析的时间；柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则固定液挥发流失；应综合考虑。•升温速率快会加快载气流速，也会使载气携带组分过快流出，导致保留值相近的组分难以完全分离。•柱温提高，会使各组分的挥发靠拢，不利于分离，柱温不能太低，被测组分在两相间扩散速率大为减小，分配不能迅速达到平衡，峰形变宽，柱效下降，并延长了分析时间。程序升温选择原则•在使最难分离的组分能尽可能好的分离的情况下，尽可能采取较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。•对于高沸点混合物（300-400℃），希望在较低的柱温下（低于其沸点100-200℃）分析，为改善液相传质速率，可用低固定液含量（质量分数1%-3%）的色谱柱，使液膜薄一些，但允许最大进样量减小，因此应采用高灵敏度检测器。•对于沸点不太高的混合物（200-300℃），可在中等柱温下操作，固定液质量分数5%-10%，柱温比其平均沸点低100℃。•对于沸点在100-200的混合物，柱温可选在其平均沸点的2/3左右，固定液质量分数10%-15%。•对于气体，气态烃等低沸点混合物，柱温选在其沸点或沸点以上，以便能在室温或50以下分析。固定液质量分数一般在15%-20%。质谱电离方式•离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。••EI电子电离源：主要分析挥发性样品，GC-MS标准质谱图NIST谱库。国际上统一用70eV，在这一电子能的作用下可形成最多的离子，可形成相对大的分子离子峰和强的碎片离子峰（与分子结构有关）。有些化合物的分子离子不出现或很弱。MSsourcetemperature230℃。••CI化学电离源：软电离技术，EI有些分析不了，CI可以分析易气化样品的分析，GC-MS非标准质谱图，不能谱库检索。•FAB快原子轰击源：极性强，分子量大难气化的样品的分析。•ESI电喷雾电离源:液相色谱质谱联用仪，软电离方式，适合于分析极性强的大分子有机化合物。•APCI大气压化学电离源：中等极性的有机化合物，是ESI的补充，得准分子离子，单电荷离子。EI源的优、缺点•1结构简单、温控和操作均较方便•2电离效率高、所形成的离子动能分散小•3性能稳定、所得谱图是特征的、能表征组分的分子结构（目前大量的有机物标准质谱图均是用EI源得到的）•4样品必能气化，不适于难挥发、热不稳定的样品•5有的化合物在EI方式下分子离子不稳定、易碎裂，得不到分子量信息，谱图复杂解释有一定困难•6EI方式只检测正离子，不检测负离子质量检测器数据采集模式•全扫描模式（Scan）和选择离子模式（SIM）SIM比Scan的灵敏度高三个数量级。•全扫描模式是在色谱运行期间连续获得的，记录的强度既是时间（色谱信息）又是质量（质谱信息）的函数。•选择离子模式中，灵敏度可通过仅检测少数几个选定的m/z成比例地增加记录时间的办法加以增强。提高灵敏度、改善峰型和精确度。用于痕量分析、复杂机制和常规定量。•阈值的设置：数据采集时，为限制采集的峰数，可以根据本底噪声的信号水平设置一个阈值，计算机采集数据时，只有强度大于或等于阈值的信号才会被保留下来。谱图分析---定性分析•主要是库检索，再结合文献数据，一般匹配度应高于80以上，库检索一般为PBM检索，不用化学工作站检索。常用的谱库•NIST库：美国国家科学技术研究所出版。•NIST/EPA/NIH库：美国国家科学技术研究所、美国环保局、美国国立卫生研究院共同出版。•Wiley库:3个版本，同一化合物可能有重复的不同来源的质谱图。•农药库、药物库、挥发油库。•前三个通用，后三个专用，NIST/EPA/NIH库应用最广泛。使用库检索注意问题•1电离条件：EI源，70eV电子束轰击。•2被检索的质谱图应该是纯化合物的质谱图，扣除背景干扰对检索是否正确十分重要。现在的质谱数据系统都带有本底扣除功能，关键是本底的选择是否正确。•3在总离子流图中选择哪次扫描的质谱图进行检索,对检索结果有影响。•4匹配度(相似度)最高的化合物不一定就是要检索的化合物，还要考虑其他有关信息。•谱库检索的好坏除了与谱库中谱图的数量和参考谱图的质量外，最重要的是待鉴定的未知物谱图是否正确。•仪器调谐方式不对，或数据采集时最强峰超量程，因此采集的谱图中离子的相对强度不对。•②采集数据或处理谱图时设定的低质量范围过高，重要的低质量特征峰没出现。•③色谱分离不好，得到的不是单一组分的质谱图，或本底峰干扰严重。•④谱图处理不当，得到的谱图质量不高。一个色谱峰可以有多张质谱图，使用平均谱或任一张谱图，选择是否正确，背景扣除是否正确，都影响谱图质量。•⑤检索参数的选择（如质量范围等）是否正确。影响检索结果的原因谱图分析---定量分析•定量方法有面积归一化法、外标法、内标法(internalstandardmethod)。面积归一化法•面积归一化法中各组分浓度以面积百分率表示，该结果可以确认大概的浓度，但有误差。•优点：1）无需做校正，简便，快速2）进样量不严格要求•缺点：1）所有组分都流出且被检测到2）所有组分的检测灵敏度都相同•要求：所有物质都出峰，各物质响应因子比较接近，且主要物质含量足够大，各峰型都比较尖锐且对称；峰高，只要不超过检测的线性范围最大值的一半就行。外标法•外标法是目前应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。•优点：1）不需所有峰都流出或被检测到2）只对所测组分作校正•缺点：1）进样量必须准确2）仪器必须有良好的稳定性内标法•内标法指在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。能减少进样误差对定量结果的影响。•优点：1）进样量不严格要求2）只对所测组分作校正•缺点：1）必须在样品中加一内标组分2）操作较为繁琐3）选择内标物困难•内标物的选择原则：内标物的峰与试样中的所有成分的峰完全分离。内标物的峰与目标成分的峰保留时间不应差太远。内标物具有与分析目标成分类似的化学性质。•加入等体积等浓度的内标物，即事先配好内标溶液（等浓度），然后在每个待测样品中加入等体积的内标溶液，需要称重以确保加入相同量的纯内标物。•加入相同量的内标是指加入后各对照液内标的浓度相等。•ppm用溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度,也称百万分比浓度。•三种定量方法均要求对各色谱峰进行积分，质谱工作站通过两种积分方式，即RTE积分器（RTEIntegrator）和化学工作站积分器(ChemStationIntegrator)。RTE积分器•RTE积分器对相对简单的色谱图（其中的峰很窄且已完全解析）提供了一种非常快速的积分。尤其适用于targetcompoundanalyses(目标化合物分析)。缺省参数假设待积分的数据是在整个色谱图范围内使