蛋白印迹实验报告

---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------1蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Westernblot的原理及其意义，掌握Westernblot的操作方法；2.应用Westernblot技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------2位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39mmol/L），Tris碱（48mmol/L），SDS（%），200ml甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5%脱脂奶粉，%叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS缓冲液含%Tween20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB（二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。6．5xPBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na2HPO4,NaH2PO4,40gNa---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------3Cl,用/LNaOH调pH至，加水定容至2升。高压灭菌20分钟，室温保存。用前稀释至1x。7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------4滤纸上。再将一张NC膜放上，加上3-4张滤纸，每加上一种物品都要精确对齐，并确保没有气泡。再铺上纤维垫，最后将电极板夹上，夹上夹子插进转膜槽中。5．按下示意图，接上电源（凝胶一边接负极，尼龙膜一边接正极），恒流电泳小时，/cm2膜。6．关闭电源，将尼龙膜取出，置塑料盒中用丽春红S染色约5分钟，回收丽春红S，然后用蒸馏水洗去背景染料显色，室温稍干燥后用铅笔描下Marker所在位置，然后用PBST浸泡几次，完全洗去丽春红S染料（4）。〈二〉封闭7．将膜放入塑料盒中，加入20mL封闭液，置脱色摇床中缓慢摇动，室温1小时或4℃封闭过夜（5）。〈三〉靶蛋白与第一抗体结合8弃去封闭液，加入含有第一抗体的封闭液5～10mL，室温平缓摇动温育3小时。然后尽量回收抗体溶液，-20℃保存，可重复使用（6）。---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------59．用PBST室温洗膜3次，每次10min（7）。〈四〉与第二抗体反应10.弃去PBST溶液，加入适量（～5-10mL）含有第二抗体的封闭液，室温下平缓摇动温育1小时（8），尽量回收第二抗体。11．用PBST溶液漂洗尼龙膜3次，每次10钟。〈五〉显色12．把尼龙膜置于稀释50倍的DAB溶液中，轻轻摇动，显色约10－30min，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用水漂洗，最后转移至PBS溶液中，拍照或扫描（9）。注意事项与提示（1）电泳时间要根据目标蛋白大小而定。（2）为避免干燥，可在胶上滴转膜缓冲液或浸泡在转膜缓冲液中，使其离子强度和pH值与转膜缓冲液一致。（3）可用一圆棒在滤纸上来回滚---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------6动以驱除气泡。（4）染色后整张膜呈红色，由于丽春红S与膜上蛋白的结合很不紧密，因此脱背景色时要注意观察，勿将红色的蛋白带也洗去；脱色完毕，观察转移效果，并用铅笔在分子量标准带处做上记号。如果用预染的Marker，则不需要用丽春红染色。（5）封闭液的作用是封闭膜上没有蛋白带的部位，以减少抗体的非特异结合；我们推荐4℃封闭过夜。（6）抗体的用量以浸没尼龙膜为准，用封闭液稀释第一抗体，抗体的稀释度要由预实验来定，下列数值可作为参考：多克隆抗体：1：100到1：5000小鼠腹水：1：1000到1：10000（7）PBS对膜上的蛋白没有影响，但可洗去剩余的封闭液和其它杂质；Tween20是一种非离子型去污剂，含适当浓度Tween20的PBST可洗去非特异结合的抗体，使整张膜的背景更清晰。（8）一般所用的第二抗体（抗免---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------7疫球蛋白或蛋白质A）为酶标抗体，如辣根过氧化物酶标抗体或碱性磷酸酶标抗体。第二抗体的稀释度一般为：1：200到1：2000。本实验中第一抗体为鼠源单克隆抗体，因此二抗应选择兔抗鼠抗体，若一抗为兔源多克隆抗体，二抗应选择羊抗兔抗体。（9）DAB有致突变之嫌，因此要戴手套操作；辣根过氧化物酶显色的条带在阳光下几个小时就会褪色，因此要尽快拍照。实验安排试剂配制－电泳－转移：1天；杂交－显色－结果处理：约1天。实验报告要求与思考题1．用数码相机拍下丽春红S染色和最后抗体显色的结果，计算目标蛋白的分子量，并对结果加以分析。2．对实验中出现的其它问题进行分析讨论。3．进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------8篇二：3蛋白印迹技术《分子生物学实验》实验报告实验名称：蛋白印迹技术姓名：陈杰学号：3140104666序号：25同组同学：唐陈曦带教教师：刘伟俞萍实验日期：2015年9月29日目录1.原理........................................................................................................................................3印迹技术.........................................................................................................3RT-PCR..........................................................................................................................4聚丙烯酰胺凝胶双向电泳---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------9（2D-PAGE）..................................................................52.操作步骤................................................................................................................................5安装垂直板型电泳装置.............................................................................................5凝胶的制备.................................................................................................................5转膜.............................................................................................................................6封闭.............................................................................................................................6一抗反应.....................................................................................................................6洗涤...............................................................---------------------------------精选公文范文------------------------------------------精选公文范文----------------10..............................................................7二抗反应.....................................................................................................................7洗膜.............................................................................................................................7检测....................................................................................