噬菌体的检测

噬菌体的检测双层琼脂平板法测定噬菌体操作：器材以及药品：1.器材：试管及试管塞（已灭菌）、移液枪（200ul以及5ml）以及相应的无菌枪头、90mm平板（已灭菌）、250ml三角瓶、酒精灯、琼脂粉、分离提纯的噬菌体液以及敏感菌（已经活化好的）。方法及步骤：1.配制培养基：LB液体培养基（1000ml水：10g蛋白胨：5g酵母粉：5g氯化钠）、1.5%的固体培养基、0.7%的半固体培养基；2.倒平板：将1.5%的固体培养基熔化，每个平板倒10-15ml的1.5%固体培养基，然后静置至平板上没有水珠为好，平板数根据实际需要而定；3.分装0.7%的半固体培养基：将0.7%的半固体培养基加热熔化，然后用5ml的移液枪向每个试管（已灭菌）加入5ml的半固体培养基；试管的数量和上一步平板数是相同的。如果试管很多，防止培养基凝固，可将已分装好的试管放入水浴温度为55℃左右的水浴锅中保温；4.等到试管中培养基温度降至45℃-50℃之间（不烫手）时，迅速向试管中加入100ul敏感菌和100ul的噬菌体液（噬菌体浓度要适当，这样才能看到明显的噬菌斑），摇匀；5.将摇匀好的该培养基迅速倒入之前已倒有1.5%固体培养基平板中，晃动平板，使其铺满平板，静置；6.待所有平板倒好后（最好静置2h左右），将其放入30℃恒温箱中培养12h左右，即可观察有无噬菌斑。注：所有操作在酒精灯旁进行！噬菌斑效果图培养噬菌体的方法：一.液体培养法1.将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。2.将噬菌体原液100μl与寄主细菌悬浮液300μl均匀混合，静置15分钟使其感染。3.将混合液接种至含10ml新鲜液体培养基的试管中，于适当温度下振荡培养约8~24小时，培养时间依噬菌体之不同而异。4.将培养液移入离心管中，以10,000rpm(5,000g)离心10分钟，以沉淀寄主细菌。5.将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄主细菌之噬菌体原液。但因噬菌体原液呈透明状，无法以肉眼直接判断其增殖效果，故应测定其效价以确认增殖培养之成效。二.双层琼脂培养法1.将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。2.将噬菌体原液100μl与寄主细菌悬浮液300μl均匀混合，静置15分钟使其感染。3.将混合液加入5ml冷却至45℃的0.7﹪琼脂培养基中，均匀混合后立即平铺在已倒好的1.8﹪琼脂培养基平板上。4.待平板凝固后移至适当温度之培养箱中，一般培养8~24小时，培养时间依噬菌体之不同而异。5.以上述相同之步骤制作另一不含噬菌体之对照组。6.将培养好的平板与对照组比较其澄清度，一般含噬菌体之平板呈澄清状，而仅含寄主细菌之对照组则呈混浊状。7.将含有噬菌体之平板置于-20℃下4~5小时后，取出置于室温下解冻。8.将解冻后产生的液体移入离心管中，以10,000rpm(5,000g)离心10分钟以沉淀寄主细菌。9.将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄主细菌之噬菌体原液。三.表面琼脂培养法1.将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。2.将寄主细菌悬浮液3ml均匀平铺于1.8﹪琼脂培养基平板上，静置2小时。3.将多余的寄主细菌悬浮液吸出，再将噬菌体原液0.3ml均匀涂抹于平板上。4.于适当温度下培养约16~24小时，培养时间依噬菌体之不同而异。5.取5ml新鲜液体培养基加入平板中，以L形玻棒刮洗下平板表面之菌体。6.将刮洗下之液体移入离心管中，以10,000rpm(5,000g)离心10分钟以沉淀寄主细菌。7.将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄主细菌之噬菌体原液。噬菌体样品的分离及样品制备：1.分离源为液体时，可用离心分离，在10000rpm转速下离心10min，取上清液，去除沉淀的杂菌；2.要从设备和容器表面分离噬菌体，可用灭菌棉签用力擦拭容器表面，然后将棉签浸入2-3ml培养液中充分洗脱，以此液体为分离样品；3.由空气中分离噬菌体时，可用真空泵抽引，将空气抽入培养基，以此培养基为分离对象；4.在噬菌体密度高的空气区域内，只要将长了菌的平皿打开，在空气中暴露30-60min即可；5.对噬菌体含量少的样品，可先进行扩增。将样品接入敏感的宿主菌中培养一段时间，使噬菌体增值。为了避免杂菌繁殖，可加入过滤样品或者采用抗药性宿主菌，在加抗生素的条件下培养。若可能有两种以上的噬菌体存在，应该缩短培养时间，以免增殖快的噬菌体在数量上压倒增值速度慢的噬菌体。采用多级膜过滤器也可达到浓缩目的。