细菌基因转移和基因重组

第六章微生物基因转移微生物基因的交流基因重组：是指来自两种不同亲本的DNA分子在同一生物体内经过交换作用产生新的重组DNA分子的现象。细菌遗传重组的自然机制包括细菌的接合（conjugation）转化（transformation）转导（transduction）性导（sexduction）第一节接合（Conjugation）概念：F+conjugationHfr(highfrequencyrecombinant)conjugation•接合是指DNA从活的供体细胞转移至受体细胞的过程。•输出遗传物质的个体称为供体（donor），又称为“雄性”。接受外源遗传物质的个体称为受体（receptor），又称为雌性1946年，Leaderberg和Tatum发现E.coli可以通过结合交换遗传物质。选用两个不同营养缺陷型（auxotroph）的E.coli菌株，A和B。A菌株，met－bio－，需要在基本培养基上补充甲硫氨酸（met）和生物素（bio）才能生长；B菌株，thr－leu－，需要在基本培养基上补充苏氨酸（thr）和亮氨酸（leu）才能生长。采用多营养缺陷型是为了防止回复突变干扰试验结果。U型管试验(见图）说明：两个菌株间的直接接触是原养型细菌出现的必要条件，这就排除了转化的可能。1952年，Hages通过实验证明，在结合过程中，遗传物质的转移是单向的。在结合过程中，到底是什么东西由雄体输入了雌体呢？•Gram-positive:stickysurfacemolecules•Gram-negative（阴性菌）:sexpilus（性菌毛）F因子的特征•携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示。没有F因子的菌体称为受体菌，又称雌性，用F－表示。•F因子是双链环状DNA，分子量大约是3.5×106，是染色体外遗传物质，是质粒的一种，在分类学上属于附加体（episome）。•它既能以自主状态存在于细胞质中，又能整合到细菌的染色体内。•F小环与主染色体大环之间发生一次交换就可以插入到宿主染色体中。•F因子整合到E.coli染色体上以后，该菌株就成为高频重组株（Highfrequencerecombination），以Hfr表示。MechanismofDNAtransferduringconjugationinGram-negativebacteria大肠杆菌F因子的遗传图谱oriT：originoftransferTheoriTsequence1.About300bp2.ContainsinvertedrepeatsandanAT-richregion.4.DNArecircularization,complementarystrandsynthesis,andvegetativereplicationintherecipient.1.Donor（供体）andtherecipient（受体）cellcontactandmating（配对）bridgeformation,2.DNArelaxosome（松散）formationinitiated（启动）byasingle-strandednickwithintheoriT,3.conjugative（结合）“rollingcircle”replication（复制）andsingle-strandedDNAtransfertotherecipient（受体）,细菌结合的过程质粒介导的染色体DNA的转移FormationofHfrstrainsHfr细胞的转移F+品系称为低频重组（lowfrequencyrecombination，Lfr)：F因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，大约是每百万个细胞发生一次重组。Hfr品系称为高频重组（highfrequencyrecombination，Hfr）：因为Hfr细胞与F-细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给受体F-，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在她们之间就可以发生重组，重组频率可达到0.01以上。当处于游离状态时，细菌为F＋，当整合到宿主染色体上时即为Hfr品系。所以经吖啶橙处理不会丢失F因子。Hfr和F－细胞接触时OriT活化，进行滚环复制。开始时，缺刻蛋白识别并结合在OriT区，切开单链，以另一条链为模板，在3′-OH上从头合成。5′端沿箭头方向延伸，将宿主的DNA移到受体中。由于整合后控制合成性伞毛的基因位于DNA环的末端,一般尚未进入受体细胞前，接合管就已经断裂，使转移中断，故Hfr杂交的后代不能获得合成性伞毛的基因，故不能产生性伞毛而呈F－的性状。第四节中断杂交与重组作图一、中断杂交实验原理基因从Hfr细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入F-细胞的时间和次序制作基因图谱。Wollman和Jacob于1954年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验：Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs×F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中用来测定基因位置的一种方法。二、中断杂交作图中断杂交实验结果基因转入时间（min）频率thr+8100leu+8.5100azs990Tis1170lac+1840gal+2525不同基因在F-中出现的时间和达到的稳定转移频率不同，表明它们同转移起始点之间，以及它们之间的顺序和距离不同。0510152025minOazTilacgalE.coli中断杂交作图基因距离以分钟为单位同一个Hfr菌株的转移的起始点在以及转移顺序在不同实验中都是相同的。但一个F+品系可产生许多Hfr品系，这是因为F因子在细菌染色体上有许多插入位点而且其插入取向不同而形成的。用这些不同Hfr菌株进行中断杂交实验，则它们的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同。（P153图6-9）中断杂交实验和基因定位思考题：现分离得到一株StrR的大肠杆菌，且不能利用乙酸盐作为碳源(ace)，为了定位突变位点，该突变株与四株StrSace+Hfr供体菌株（图谱如下图，箭头表示oriT的位置和方向）分别杂交3.如果得到以下结果，ace突变位于什么位置？（以分钟表示）1.通过什么选择接合子？2.怎么淘汰供体菌？Hfr4Hfr1Hfr2Hfr3F-、F＋、F’和Hfr的关系三、细菌重组的特点Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，一般说很少有整条Hfr染色体转入F-细胞的，因此：（一）F-细胞得到的只是F因子的一部分，F因子其余部分依赖于整条Hfr染色体的转移，这样Hfr×F-杂交中选出的大多数重组子仍为F-。（二）F-受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体（partialdiploid)或称为半合子(merozygote)。供体与受体的重组是内基因子（F-染色体DNA）与外基因子（Hfr部分染色体DNA）的同源部分配对、交换，产生重组子。其中单交换产生的是不平衡的部分二倍体线性染色体，而双交换产生的是有活性的环状重组子和片段。细菌重组的特点（a）：接合后形成的部分二倍体，包括外基因子和内基因子；（b）：内基因子和外基因子之间单交换形成一个线性染色体；（c）：双交换形成一个完整的重组染色体和一个游离片段，这一片段随以后的分裂而丢失。--可见：原核类中的交换并不像真核生物那样在两整套基因组间进行，而是在一完整的基因组（F-内基因子）与一不完整的基因组（Hfr外基因子）间进行，即在部分二倍体间进行。因此，在细菌的重组中有下列两个特点：1、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子2、不出现相反的重组子，所以在选择培养基上只出现一种重组子。三、重组作图如果2个基因间的转移时间2min则用中断杂交作图不可靠，应采用传统的重组作图法。●杂交Hfrlac+ade+×F-lac-ade-lac+乳糖不发酵ade-胸嘌呤缺陷型用完全培养基但不加腺嘌呤，可选出F-ade+的菌落●由于lac+ade-近，两者相继进入时间相距很短，难以准确界定，所以只能根据产物确定。●如果选出ade+同时也选出lac+，说明lac-ade间没有发生过交换；如果是lac-ade+说明发生交换。Hfrlac+ade+F-lac-ade-F-lac-ade-Hfrlac+ade+F-lac+ade+F-lac-ade-Hfrlac+ade+F-lac-ade+F-lac-ade-A：外基因子与内基因子之间未发生重组；B：lac-ade两基因之外发生双交换；C：lac-ade两基因间发生交换产生重组子。●重组率=lac-ade+/(lac+ade+)+(lac-ade+)×100%=22%两个位点之间的时间单位约为1min，可见1个时间单位（分钟）大约相当于20%的重组值。用重组率与中断杂交法测的基因距离大致符合的，根据接合的实验，用中断杂交法基因重组等方法已绘制出大肠杆菌K12环状遗传图（图10-17）。A:B:C:第五节F’因子与性导一F`因子与F`菌株整合到细菌中的F因子也可以重新离开染色体，成为独立的环。这个过程是整合的逆过程，称为环出（loopingout）。F因子在环出过程中并不是完全准确无误的，往往连同部分染色体片段一同离开。部分染色体DNA与FDNA的杂合环称为F′因子F`菌株：指带有F`因子的细菌。F′所携带的细菌DNA片段的大小不等，可以是一个基因，也可以长达细菌染色体的一半。F′因子以极高的频率转移它所携带的基因。F′因子有极高的自整合率，且整合在一定的座位上，因为它有与细菌染色体同源的区段。F因子整合在染色体上的位点不是固定不变的。例如，某一Hfr系（stock）的F因子在环出时带走了lac+，当此F’转移到F—lac—以后，受体菌（receptor）成为F+lac+的比率很高。但lac位于染色体的远端，在中断杂交试验中，只有1/100的受体成为F+lac+。这是因为F’携带lac+基因进入受体后使lac座位成为部分二倍体F’lac+/lac—，lac+对lac—是显性，所以部分二倍体的表现型是lac+。二、性导F’因子转入受体细胞后，由于引入体细胞的部分基因，从而形成部分二倍体，这种利用F’因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程叫性导（sexduction或F’---duction）性导的意义：（1）性导产生部分二倍体，为研究单倍体细菌中等位基因间的显隐性关系提供了可能的途径。（2）环出时，形成大量的F′因子，不同F′因子可能携带E.coli的不同基因，因此并发性导是建立遗传图谱的重要途径。（3）性导形成的部分二倍体也可用作互补试验，确定两个突变型是属于同一个顺反子还是属于不同的顺反子。第六节转化与转导作图一、转化(transformation)(一)、细菌转化实验(二)、转化过程*(三)、共同转化与遗传图谱绘制一转化（transformation）1.Transformation转化:细菌通过细胞膜摄取周围环境中DNA体段，并通过重组将其整合到自身染色体中的过程，称为转化。NaturaltransformationDefinitions2.Donor（供体）:thebacteriumfromwhichtheDNAwasextracted（抽取）.3.Recipient（受体）:thebacteriumthatisintendedtotakeuptheDNAfromitsenvironment4.Competence（感受态）:therelativeabilityofrecipientstotakeupfreedsDNA5.Transformant转化:arecipient受体thathassuccessfullyincorporated整合donorgenesintoitsgenome6.Transfection转染:transformationoface