斑马鱼的培养及TALENs技术的应用

1“斑马鱼的培养及TALENs技术的应用”预习报告一、实验原理1、TALENs实验技术原理类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALEDNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变。2、斑马鱼的生活习性以及作为模式生物的优势斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼），成年鱼全身仅长4－5厘米，因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。斑马鱼很容易在实验室饲养，一般3个月就可以达到生殖成熟期，雌鱼每次产卵200枚左右，一生可产卵数千枚，斑马鱼所产之卵经24小时即可胚胎发育成熟，仔鱼期只有1个月。更独特的是，斑马鱼的卵是透明的，整个胚胎发育在体外完成，也是透明的。优势：显著优势在于体积小(3cm～4cm)，可在较小的空间大量繁殖；产卵量高(每周200多个)；发育快，许多组织在受精后24h开始形成；成熟周期短；体外受精且胚胎透明，可在体视解剖镜下观察；单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易；精子可以冷冻保存。所有这些特点都使斑马鱼非常适合于遗传学的研究。斑马鱼的基因组中大约含有30000个基因，这个数目与人类差不多，而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在分子水平上85%与人相同。二、实验目的通过本实验可以了解TALENs实验技术的基本原理，熟悉其几个关键实验步骤的操作，学习显微注射技术，从而能够独立应用这些技术进行相关学术研究。三、实验器材1、实验仪器超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex)、NanoDrop(ND-1000Spectrophotometer)、PCR仪，体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机1.3.2耗材细菌培养皿、移液枪、移液枪枪头、Eppendorf离心管、PCR管、显微操作仪，倒置显微镜，拉针仪，胶头滴管，胶固定板。2、实验试剂NEB限制性内切酶：BstNI-HF、KpnⅠ、NheⅠ-HF、NotⅠ-HF或SacⅡ、SpeⅠ-HF。试剂盒：DNA连接试剂盒(TaKaRa,D6020)、微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂2盒、快速DNA产物纯化试剂盒、SP6mMESSAGEmMACHINEKit(Ambion,AM1340)(用于体外转录TALENmRNA)、T载体试剂盒(pMD®18-T,TaKaRa,D101A)琼脂糖、DNAmarker、1×TAE、氨苄青霉素、LB琼脂培养基、LB液体培养基、2×TaqMasterMix(含染料)、碱性磷酸酶(CIAP,TaKaRa,D2250)、1mol/LTris(pH8.0)、50mmol/LNaOH、70%乙醇、超纯水(ddH2O,18MΩ)，酚红3、实验材料大肠杆菌，斑马鱼胚胎，TALE单体质粒系列，pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列四、实验步骤1、TALE片段的设计（参考基因：HSF4）【示例1】斑马鱼基因HSF4TALEN靶点信息基因名左半位点长度(bp)Spacer长度(bp)Spacer中的内切酶右半位点长度(bp)Hsf41815BstNI(CCWGG)19(加下划线)(加下划线)5′-tGCACGCGCGTCCCCGCTGcccaacgaagcctggGTCGCGTTGCGCCGCCGCCa-3′3′-aCGTGCGCGCAGGGGCGACgggttgcttcggaccCAGCGCAACGCGGCGGCGGt-5′2、TALEN片段的克隆（写出详细的操作步骤）2.1酶切（第一次）（质粒的结构、种类、酶切体系、过程等）1）向离心管中加入组装好的TALE重复序列载体pMD-TALE，用SpeⅠ和NheⅠ双酶切；向离心管中加入pCS2-T-PEAS载体，用NheⅠ分别单酶切。1．新提的质粒，在10uL的体系中进行处理，即：体系I体系IITALE重复序列载体pMD-TALE10μL0pCS2-T-PEAS载体05μL10×缓冲液2μL1μLSpeⅠ1μL0NheⅠ1μL1μLddH2O6μL3μL32．37℃，保温2-3h。3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。2.2琼脂糖电泳（1）琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mLTBE缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。（2）胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。(3)加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(4)电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。(5)染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。2.3割胶回收（试剂盒名字、过程）名字：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）过程：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。(1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）(2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。(3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µl，则加入100µlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。注意：对于回收300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。(4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集4管中。注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。(5）向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心。(6）重复操作步骤5。(7）将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。(8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。注意：洗脱体积不应小于30μl，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10mMTris-Cl,pH8.0)洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。2.4酶连（体系的设计、操作过程）（1）pCS2载体骨架CIAP去磷酸化,快速DNA产物纯化试剂盒回收后备用（2）将上述去磷酸化的pCS2载体骨架与双酶切后回收的TALE重复序列片段混合，加入连接酶连接2.5转化（操作过程及对照组实验设计）(一)大肠杆菌感受态细胞的制备1．从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mLLB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。4．于4℃，5000rpm离心10min。5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入占总体积95％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于Ep管中，-70℃条件下可保存半年至一年。(二)细胞转化取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化见上图（单位：μL）：5将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μLLB液体培养基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。(三)平板培养取各样品培养液100μL接种于含氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂匀。37℃培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。2.6重组质粒的鉴定I——PCR鉴定（含保种、PCR、电泳）挑取单克隆菌落,液体培养基培养,用G-For作为上游引物对菌液进行PCR鉴定。将PCR产物电泳。（如果TALE重复序列连入的方向正确,就能扩增出条带,否则无法扩增出条带。可据此鉴定连入方向正确的菌落。）2.7重组质粒的鉴定II——酶切与测序（质粒提取、酶切、测序）（1）提取质粒（pCS2-TALEN载体）：1）．取1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，10000rpm离心3min。2）弃上清，加入150μLGET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。3）．加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。4）加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5）4℃，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mLEp中，