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低分子量及寡聚透明质酸的应用研究董爽，崔国梁，李取泉新疆阜丰生物科技有限公司，831300【摘要】：本文对低分子量透明质酸（LMw-HA）和寡聚透明质酸（o-HA）的生物活性、制备方法及应用研究概况进行了综述。【关键词】：透明质酸；低分子量；寡聚引言透明质酸（hyaluronicacid，HA），又称玻璃酸，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-（1→4）糖苷键和β-（1→3）糖苷键连接组成的无分支的糖胺聚糖（见图1）[1]。图1.透明质酸的结构示意图HA是一种酸性粘多糖，存在于结缔组织以及关节滑液、眼玻璃体、脐带、软骨、皮肤、鸡冠和某些细菌的荚膜中。HA因其独特的流变学特性、粘弹性、良好的生物相容性以及较强的保湿性而作为关节润滑剂、术后防粘连剂、眼科手术辅助剂、化妆品保湿剂、食品添加剂等[2]。随着国内外对HA研究开发不断取得新的进展，近年来HA在临床诊断、作为缓释制剂药物媒介等方面的研究不断深入，低分子量HA(lowmolecularweighthyaluronicacid，LMw-HA)和寡聚HA（oligo-HA）也越来越引起科研工作者的关注，并取得了一定的研究成果。LMw-HA和oligo-HA的生物活性目前大量的研究表明，Mr作为HA的一个重要参数对HA的活性有较大影响，HA具有分子量依赖性，LMw-HA和oligo-HA具有与普通HA完全不同的生物活性，甚至表现出截然相反的作用。研究表明LMw-HA和oligo-HA有其特殊的生理活性，LMw-HA的相对分子量范围尚无统一标准，一般为(104-5×105)，寡聚HA（oligo-HA）的分子量一般为104以下[3]。1.1抗肿瘤作用体内实验表明，LMw-HA能降低CRC肿瘤细胞生长，提高肿瘤小鼠存活率，且作者推测其机制为通过树突状细胞(dendriticcells，DCs）增加抗原递呈从而发挥抗肿瘤作用。LMw-HA抗肿瘤的作用机制尚无定论，这可能与其Mr、浓度以及与肿瘤微环境中其他基质成分的反应有关[4]。1.2促血管生成West等发现4-25个双糖单位的低分子量HA具有促进血管生成的活性。大量实验己证明低分子量HA(3-16双糖片段)可明显促进主动脉及毛细血管内皮细胞的增殖和移动[5]。1.3免疫调节作用大量研究报道，高分子量HA和低分子量HA对炎症具有不同的生理作用。高分子量HA可以抑制巨噬细胞的吞噬能力，而低分子量HA可促使巨嗜细胞表达一些与炎症有关的因子。Kobayashi等的实验证明，低分子量HA可以促进环加氧酶-2(C0X-2)的表达，从而增加前列腺素的形成，由此引发炎症[6]。1.4促炎症反应Mckee等[7]就发现LMWHA能诱导巨噬细胞表达单核细胞化学吸引蛋白1(mononuclearcellschemicalattractprotein-1，MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白1α(macrophageinflammatoryprotein-1α，MIP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白1β(macrophageinflammatoryprotein-1β，MIP-1β)等趋化因子，从而引起炎症。1.5促进骨生成作用有专利报道，Mr为(2×104-6×104)的低分子量HA可刺激体外培养的骨细胞的增生，增加培养基中骨细胞集落的数目和单个集落的面积。由此可见关节腔注HA，不但可以起润滑作用，HA经过一段时间被降解成低分子量HA，还具有促进细胞生长的作用[8]。1.6促创伤愈合作用低分子量HA能够保护肉芽组织免受氧自由基的破坏，并且能够促进伤口愈合。实验证明，高分子量HA不能透过表皮层进人真皮层，而低分子量HA能够渗透到真皮层，清除氧自由基[9]。2.LMw-HA和oligo-HA的制备由于从自然界直接获取的HA一般相对分子量都较高，其应用受到了限制。因而，国内外开始对HA的降解方法及其降解产物进行大量研究。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类，所获得的低分子量透明质酸(LMw-HA)在医药、化妆品、食品等领域有不同于高分子量透明质酸(HMw-HA)的生理功能和应用[10]。2.1物理降解法物理降解法包括加热、超声波降解、紫外线、机械剪切力降解、γ-射线辐射降解、60Co射线、微波降解等[11]。物理降解法不需要化学试剂，不污染环境，后处理过程简单，且得到产品的Mr分布范围窄、热稳定性好，但是此法降解时间较长，不利于大规模生产，为降低生产成本，则多使用化学降解法。2.2化学降解法化学降解法主要有碱水解、酸水解和氧化降解[12]。化学降解方法，通过控制化学试剂的加入量和反应时间即可控制产品的Mr，降解时间短，降低了生产成本，但是其缺点在于反应条件较剧烈，不但破坏糖链上的糖苷键，且可能破坏单糖残基结构，产品也可能存在氧化剂的残留，降低产品质量。2.3生物降解法目前最温和的降解方法是利用透明质酸酶降解HA分子量，酶法降解最适合制备oligo-HA。此法很好的解决了化学法降解导致的单糖残基的结构遭到破坏的问题。透明质酸酶是以降解HA为主的糖苷酶，是使透明质酸产生低分子化作用酶的总称[13]。目前，按照最适反应pH值、氨基酸序列同源性及来源、结构和作用机制划分，分类如表1所示：表1.透明质酸酶分类分类来源作用底物作用机制终产物内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶脊椎动物及毒液软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、HA水解酶、转糖苷酶，作用于β-1,4糖苷键四糖内切-β-葡萄糖醛酸水蛭唾液腺和十二指特异性降解HA水解酶，作用于β-1,3糖苷键四糖或己糖苷酶肠虫透明质酸裂解酶梭菌属、微球菌、链球菌、链霉菌透明质酸、软骨素、硫酸软骨素作用于β-1,4糖苷键，β-消去机制2-（乙酰基氨基）-2-脱氧-D-葡萄糖为主现阶段HAase制备方法有提取法、发酵法和基因工程法[14]。2.3.1提取法主要采用哺乳动物睾丸、动物毒液和鱿鱼软骨组织作为来源材料，而美国FDA从1998-2011年收到98例患者不良反应报告，主要原因在于动物源性HAase交叉感染[15]。2.3.2发酵法发酵法目前已有采用缓症链球菌MTCC2695作为表达菌株[16]，但是所采用的生产菌株是致病菌，发酵过程中不可避免地形成内毒素和溶血素，现阶段仅仅适应于基础研究或者用于HAase工具酶领域。2.3.3基因工程法近年来基因工程的发展使得多种来源HAase得到了进一步研究，已在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫细胞和植物细胞中完成重组HAase的表达。鉴于哺乳动物HAase与细菌HAase氨基酸同源性差异较大，大肠杆菌更适宜于表达原核生物HAase，而表达真核生物HAase容易形成包涵体，由于大肠杆菌缺乏对真核蛋白的糖基化修饰功能，即使体外包涵体成功复性后得到的重组哺乳动物HAase仍活性较低；毕赤酵母对外源蛋白具有表达量高并且活性高，又可以选择分泌型表达，是表达真核HAase的较佳宿主。毕赤酵母在表达真核生物目的蛋白具有修饰功能，使其表达活性较高，并且毕赤酵母还具有易于高密度发酵培养和培养成本低廉等优点，是大规模制备重组人HAase的首选方法[17]。3.LMw-HA和oligo-HA的应用3.1化妆品中的应用LMw-HA和oligo-HA能渗透到真皮层，调节皮肤代谢，促进血液循环，有保健、美白作用[18]。LMw-HA和oligo-HA可用于任何种类化妆品，如表2所示。表2LMw-HA和oligo-HA在日用化妆品中的应用类别应用基础化妆品乳剂、霜剂、化妆水、美白液、润肤霜、防晒霜妇用化妆品底霜、口红、唇膏、眼睑膏、粉饼、描眉脂、面膜头用化妆品香波、发乳、护发水、啫喱水、烫发剂其他浴剂、洗面奶、化妆肥皂、药用化妆品、香水、除臭剂3.2治疗细菌性角膜溃疡中的应用临床试验证明，使用含有妥布霉素和低分子量HA的滴眼液治疗细菌性角膜溃疡，与只含妥布霉素的滴眼液相比，可显著缩短愈合时间[19]。此项研究对开发LMw-HA滴眼液有一定指导意义。3.3在口服方面的应用HA应用于美容具有保湿、增强皮肤弹性防止皮肤老化等作用，但作为生物大分子，外用不易吸收，而将HA降解成为小分子（104-8×104）口服，经肠道吸收体内降解成为单糖，可增加机体合成HA所需前体[20]。结果显示，口服吸收的LMw-HA在体内可生成高分子量HA，可表现出高分子量HA的作用。展望由于透明质酸在人体的诸多优异生物活性，使其在药物传递系统和临床医学的研究领域有广泛的应用前景。由于其良好的特性，透明质酸作为药物载体已被广泛研究，尤其低分子量透明质酸与肿瘤细胞联系紧密，因此，透明质酸作为肿瘤药物的载体具有靶向，减小毒副和缓释作用。因此，大规模生产低分子量和寡聚透明质酸是进一步研究的重点，具有深刻的科研意义，值得深入研究。【参考文献】：[1]GuraE，HuckelM，MullerPJ.PolymDegradStab，1998，59:297-302.[2]MarcellinE，SteenJA，NielsenLK.ApplMicrobiolBiotechnol.2014，98(16):6947-56.[3]RuppertSM，HawnTR，ArrigoniA，WightTN,BollykyPL.ImmunolRes.2014，58(2-3):186-92.[4]WadhwaS，MumperRJ.CancerLett.2013，28，337(1):8-21.[5]AbateM，PulciniD，DiIorioA，etal.CurrPharmDes.2010，16(6):631-40.[6]AbateM，PelottiP，DeAmicisD，etal.UpsJMedSci.2008;113(3):261-77.[7]凌沛学.透明质酸[M].北京：中国轻工业出版社，2000，100.[8]VitanzoPCJr，SennettBJ.AmJOrthop(BelleMeadNJ).2006，35(9):421-8.[9]PowellJD，HortonMR.ImmunolRes.2005，31(3):207-18.[10]LitwiniukM，KrejnerA，SpeyrerMS,etal.Wounds.2016，28(3):78-88.[11]LaurinoC，PalmieriB，CoacciA.Eplasty.2015，108，15-46.[12]SiegmanS，TruongNF，SeguraT.ActaBiomater.2015，28:45-54.[13]GoodmanGJ.DermatolSurg.2015，41Suppl1:S164-6.[14]GasperiniAA，Puentes-MartinezXE，BalbinoTA，etal.Langmuir.2015，31(11):3308-17.[15]WuM，CaoM，HeY，etal.FASEBJ.2015，29(4):1290-8.[16]ItenovTS，KirkbyNS，BestleMH，etal.JClinLabAnal.2015，11：14.[17]GuinS，RuY，AgarwalN，etal.ClinCancerRes.2016，22(5):1274-83.[18]TrabucchiE，PallottaS，MoriniM，etal.IntJTissueReact，2002，24(2):65-71.[19]MisraS，GhatakS，TooleBP.JBiolChem，2005，280(20):20310-20315.[20]GhatakS，MisraS，TooleB.JBiolChem，2002，277(41):38013-38020.