新研究方案(研究者签字)

版本号：1.0版本日期：2015/5/18研究方案项目名称（中文）：循环黑色素瘤细胞的筛选、鉴定及其在肿瘤转移中作用和机制，并从中筛选具有特异RNA分选标志物的干细胞样细胞。项目名称（英文）：ResearchonDetectionandIdentificationofCirculatingMelanomaCellsandit`sMetastasisMechanismandSeparatingStem-likeCellswithSpecificMarkerRNAExpression研究单位：复旦大学附属中山医院申办者：复旦大学附属中山医院版本号：1.0版本日期：2015/5/181一、研究背景本研究的研究背景：黑色素瘤（MalignantMelanoma，MM）是一种具有强侵袭性、高转移性，预后极差的恶性肿瘤,MM发病率仅占皮肤恶性肿瘤病例的5%，但其死亡率占皮肤恶性肿瘤病例高达75%。研究显示14%的MM患者初诊时已发生肿瘤远处转移和淋巴结侵犯。即使行根治性切除手术，术后2年内仍有40.5%患者发生复发转移[1-5]。本课题组在前期研究中发现，外周血中存在具有循环黑色素瘤细胞（Circulatingmelanomacells,CMCs），可能是导致转移及复发的关键因素。此外，在许多肿瘤中已报道过在CMCs中有一些具有干细胞特性，本次研究将尝试分选出具有稳定传代的能力的肝细胞性CMCs。以上研究将有助于早期诊断MM，进而早期治疗，提高MM患者生存率。由于本研究已开展一段时间，因此设备和人员充足。二、研究目的本研究的主要目的：MM患者循环黑色素瘤细胞的筛选、鉴定，及其与疾病发展的关系。次要目的：探索CMCs中的干细胞样细胞，研究其分选RNA标记。以上研究有助于提高黑色素瘤患者的早期诊断及判断预后。三、研究概况3.1整体的研究设计和计划本研究为一项对照和单中心研究。3.2研究人群MM患者，诊断标准：首先，对于可疑皮损可采用ABCDE标准进行判断。A（Asymmey）不对称；B（Borderirregularity）边界不规则；C（Colorvariegation）色彩多样化，D（Diameter6mm）直径大于6mm，E（Elevation、evolving）皮损隆起、进展。如果皮损符合ABCDE标准高度怀疑恶性黑素瘤，但是有些亚型如结节性黑素瘤的皮损不能用ABCDE标准来判断。然后取活检进行组织病理学检查：见黑素细胞异常增生，大小、形状和细胞核的形状存在变异。在表皮内或表皮-真皮界处形成一些大小不一、互相融合细胞巢。巢内黑素细胞的有丝分裂（包括异常的有丝分裂）较良性色素痣更为常见，肿瘤细胞胞质中有色素颗粒。在侵袭性恶性黑素瘤中，肿瘤细胞向真皮或皮下组织浸润生长。免疫组织化学染色：肿瘤细胞S100阳性、HMB45阳性及MelanA阳性。3.2.1入选标准MM患者的入选标准：版本号：1.0版本日期：2015/5/182①按照前述的诊断标准，明确诊断为MM的患者；②本人或者由法定代理人/监护人签署知情同意书，自愿参加本次研究者；③病人临床病例资料及随访资料完整可靠。3.2.2排除标准MM患者的排除标准：①根据前述的诊断标准最终诊断为非任何类型的MM患者；②未在知情同意书上签字者或虽然已签字但在研究过程中不能配合者（包括失访，患者要求退出研究等情况）；③病人的病例资料或者随访资料存疑。3.2.3中途退出标准①受试者要求撤回知情同意书；②研究者从医学角度考虑受试者有必要中止研究；③受试者由于试验导致心理生理上的极度不适，研究者判断其无法继续。④任何突发性事件导致受试者无法取得联系，或者不能配合试验者取得试验数据。3.3病例数及分组方法试验总例数为100例MM患者。以3个CMCs作为分界点（考虑到健康人外周血中有时也有极少量的CMCs和使用仪器的灵敏度，笔者取3个细胞作为阳性指标），将患者分为CMCs+和CMCs-两组，经统计分析两组患者在肿瘤分级、浸润深度、淋巴结转移等临床特性上是否存在显著差异（P值取0.05）。3.4研究步骤及相关检查筛选期：分别按照入选标准和排除标准招募志愿者，对于疑似MM患者行组织活检，进行确认。保留完整病历。治疗期：对于MM患者，从住院病史摘录肿瘤部位，大小，性质，多少等，手术治疗过程中记录侵犯深度，是否有淋巴结侵犯（淋巴结活检判断）等；对所有入选者采10ml血液，血液在2小时内液氮冰冻保存，送肝癌研究所检测。利用rt-PCR技术检测单位血液中的CMCs。版本号：1.0版本日期：2015/5/183随访：肿瘤治疗（如果是手术从术后第一天算起，如果是放化疗或其他治疗应从一个疗程之后算起）后1个月，3个月，6个月和1年定期来我院进行复诊检查并分别采血一次，每次10ml，试验期间总共采血50ml。如果试验期间病人病情恶化，建议再次采血，每次不超过10ml。如果病人不同意不会强制采血。同时对所有入选者每月电话随访，持续2年。记录全身状况，肿瘤是否转移（包括记录转移部位，大小，性质，多少等），是否复发（包括记录复发部位，大小，性质，多少等）。3.5终点指标终点指标：证明MM患者的CMCs与肿瘤的复发、转移、病情的严重程度有关。以CMCs细胞数3为分界点，小于等于3为CTC阴性，大于为阳性，动态监测MM患者CMCs细胞数，分析CMCs是否对肿瘤的分期、治疗的预后和肿瘤的转移产生明显的影响；从病人血液中分离出的CMCs行基础性研究，包括细胞表面标记物的筛选，肿瘤细胞侵袭性，转移性的研究。有效性评估：（1）理论上的可行性及相关实验基础：我们课题组已建立了一套具有自主知识产权的CTC检测平台（专利号：201410081508.9，已发表于ClinicalCancerResearch.2014,IF=8.193），和一套成熟的CTC单细胞RNA-Seq技术流程。（2）实验室及技术保障：本课题组依托复旦大学肝癌研究所，具有完备、成熟的技术支持。拥有完备的基础研究条件及设备如流式细胞仪（MoFlo，Dakoeytomation）、低温高速离心机、多台PCR仪、AI图像分析系统及VDS凝胶图像分析系统、激光组织显微切割仪、活体荧光显微镜、ImageScanner分析系统等，能满足本课题实验所需要的条件。(3)有高效、合理的人员梯队：本课题组成员都是专业从事肿瘤转移复发的基础和临床研究人员，熟练掌握CTC检测、分子克隆、RNA抽提及PCR扩增、Westernblots和免疫组化等分子生物学技术以及细胞培养、动物实验。四、不良事件观察4.1不良事件的定义4.1.1定义不良事件：病人或临床试验受试者接受一种药品后出现的不良医学事件，但并不一定与治疗有因果关系。严重不良事件：临床试验过程中发生需住院治疗、延长住院时间、伤残、影响工作能力、危及生命或死亡、导致先天畸形等事件。4.1.2程度轻度：受试者可忍受，不影响治疗，不需要特别处理，对受试者康复无影响。中度：受试者难以忍受、需要特殊处理，对受试者康复有直接影响。版本号：1.0版本日期：2015/5/184重度：危及受试者生命，致死或致残，需立即做紧急处理。4.2不良事件的记录及报告途径受试者在采血过程中可能发生临床不良事件，比如晕血，感染导致的静脉炎等。一旦发生不良事件（包括重要不良事件），应在病例报告表上详细记录不良事件的发生时间、临床表现、处理经过和持续时间、转归以及与采血的关系；出现实验室检查异常者，须随访患者至检查结果恢复正常，或至采血前水平，或确定与采血无关。发生严重不良事件应填写严重不良事件表，并在24小时内报告申办者、伦理委员会、和卫生行政部门。五、统计分析5.1样本含量估计要估计两样本均数差异具有统计学意义运用公式2,,212ttnn，α=0.05，β=0.2，进行计算。5.2研究数据的统计与分析本试验将利用统计分析法证明试验两组在肿瘤分级、浸润深度、淋巴结转移等临床特性上上具有统计学意义，t检验：P值取0.05为界。六、研究相关伦理学6.1伦理委员会审核本方案和书面知情同意书及与受试者直接相关的资料必须提交伦理委员会，获得伦理委员会书面批准后方可正式开展研究。研究者必须每年向伦理委员会提版本号：1.0版本日期：2015/5/185交研究年度报告。在研究中止和/或完成时，研究者必须书面通知伦理委员会；研究者必须及时向伦理委员会报告所有研究工作中发生的变化（如方案和/或知情同意数的修订），并且在未获得伦理委员会批准之前不得执行这些变动，除非是为了消除对受试者明显且直接的风险而做出的变更。在发生这类情况时，将通知伦理委员会。6.2知情同意6.2.1获得知情同意的程序研究者必须向受试者或其法定代理人提供易于理解的并且经伦理委员会批准的知情同意书，并给与受试者或其法定代理人充分的时间考虑本项研究，在从受试者获得签署的书面知情同意书之前，受试者不得入组。在受试者参与期间，将向受试者提供所有更新版本的知情同意书以及书面信息。知情同意书应作为临床试验的重要文档保留备查。七、保密措施通过本项目研究的结果可能会在医学杂志上发表，但是我们会按照法律的要求为患者的信息保密，除非应相关法律要求，患者的个人信息不会被泄露。必要时，政府管理部门和医院伦理委员会及其有关人员可以按规定查阅患者的资料。八、研究项目的预期进度和完成日期自通过审核之日起研究人员将尽快进行相关试验，但由于本试验属于临床非干预性试验，不确定因素较多，因此可能需要数年完成。期望完成日期为2017年4月。九、参考文献[1]FlahertyKT.Targetingmetastaticmelanoma.AnnuRevMed,2012,63:171-183.[2]JerantAF,JohnsonJT,SheridanCD,CaffreyTJ.Earlydetectionandtreatmentofskincancer.AmericanFamilyPhysician2000,62:357–368,375–356,381–352.[3]Cancerfacts&figures2013.(ed.Society,A.C.).(Atlanta2013).[4]傅德良.1521例伴远处转移的黑色素瘤的预后因素.国际外科学杂志,1996,3:164-165.[5]SandruA,VoineaS,PanaitescuE,etal.Survivalratesofpatientswithmetastaticmalignantmelanoma.JMedLife.2014,7(4):572-6.