波棱瓜子提取物对小鼠抗疲劳耐缺氧作用的研究

基金项目：国家新药创制重大专项（2009ZX09103-349）作者简介：靳世英（1986—），男，硕士研究生。研究方向：中药药剂学。E-mail:[e-mail]作者单位：①100039北京，解放军第三〇二医院；②611730四川成都，成都中医药大学通讯作者：袁海龙（1970-），男，吉林舒兰人，副研究员，硕士生导师；Tel:[phone]E-mail：[e-mail]波棱瓜子提取物对小鼠抗疲劳耐缺氧作用的研究修改稿靳世英①②,吕俊兰①②,袁海龙①,靳士晓①②，付珊珊①②，郭静静①②[摘要]目的研究波棱瓜子提取物对小鼠抗疲劳耐缺氧的作用。方法按设定剂量连续灌胃给药7天后，观察小鼠疲劳游泳时间及耐缺氧存活时间，探索波棱瓜子提取物对小鼠抗疲劳耐缺氧的作用。结果疲劳游泳实验中，复方丹参片组、波棱素高、中、低剂量组疲劳游泳时间与空白对照组比较均有显著性差异（P0.05）；常压耐缺氧实验中，波棱高、中剂量组耐缺氧存活时间与空白组比较有显著性差异（P0.01），而复方丹参片组、波棱低剂量—组与之相比无显著性差异（P0.05）。结论波棱瓜子提取物能显著提高小鼠抗疲劳耐缺氧能力。[关键词]波棱瓜子；抗疲劳；耐缺氧StudiesonAnti-fatigueandAnoxia-resistanteffectsofHerpetospermumCaudigerumExtractsinmiceJINShi-ying①②,LVJun-lan①②,YUANHai-long①,JINShi-xiao①②,FUShan-shan①②,GUOJing-jing①②①.DepartmentofPharmacy,302MilitaryHospitalofChina,Beijing100039,China；②.SchoolofPharmaceuticalSciences,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611730,China[Abstract]ObjectiveTostudytheAnti-fatigueandAnoxia-resistanteffectsofHerpetospermumCaudigerumExtracts(HCE)inmice.Methods80miceswereadministeredwithdrugsoncertaindosesbygastricperfusionfor7days,twicedaily.Onehourafterthelastadministration,swimmingmethodwasemployedtoobservetheeffectofHCEonfatigueendurance,andswimmingtimewasrecorded;TheclosedhypoxiatestwascarriedouttostudytheeffectofHCEonthehypoxiatoleranceinmice.ResultsIntheswimmingexperiment,theresultsshowedthatcompoundDanshentabletsgroupandeachHCEgrouphadsignificanteffectsonfatigueendurancecomparedtotheblankcontrolgroup(P0.05);TherewasanotabledifferenceinhypoxiatolerancebetweenHCEgroups(high-doseandmiddle-doseHCEgroups)andtheblankcontrolgroupintheoxygendeficiencyresistanceexperiments(P0.05),butcompoundDanshenandlow-HCEgroupshadnodifferencecomparedtothecontrolgroup.ConclusionTheseresultsindicatedthatHCEhadremarkableeffectsontheincreaseoffatigueenduranceandhypoxiatoleranceinmice.[Keywords]HerpetospermumCaudigerum;anti-fatigue;anoxia-resistant藏药波棱瓜子为葫芦科植物波棱瓜HerpetospermumCaudigerum的干燥种子，主产于西藏西南部，尼泊尔和印度东北部，分布的海拔为2000~3500米。文献记载波棱瓜子味苦，性寒，泻肝火，胆热，解毒，用于治疗赤巴病，肝病，胆病以及消化不良[1]。多数藏药生长在高原低氧的恶劣环境下，其中一些在治疗缺氧和疲劳方面有显著疗效。多有文献报道波棱瓜子在治疗肝炎方面的应用，但在抗疲劳和耐缺氧方面却鲜有报道。中医认为运动性疲劳对脏腑中肝脏的危害程度最大，其最主要的治法之一为调肝理气法[2]，而波棱瓜子为治疗肝病的常用药之一，是否具有一定的抗疲劳耐缺氧作用呢？笔者从此角度出发，通过小鼠实验探索波棱瓜子在抗疲劳和耐缺氧方面的功效。1材料1.1仪器与试药SXKW数显加热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；R501B旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；波棱瓜子（采自四川省甘孜州泸定县庆丰乡，经全军中药研究所肖小河研究员鉴定为葫芦科植物波棱瓜HerpetospermumCaudigerum的干燥种子）；复方丹参片（四川蜀中制药有限公司，产品批号：0910042）；生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：110106403）；钠石灰(上海五四化学试剂有限公司)。1.2动物昆明种小鼠，SPF级，体质量18~22g，雌雄各半〔军事医学科学院动物中心，动物许可证号：SCXK—(军)2007—004〕。小鼠饲养于解放军第三〇二医院实验动物中心，笼具用过氧乙酸消毒，垫料为消毒垫料，饮用水为消毒水，室温为25℃，相对湿度为40%～70%。2方法与结果2.1波棱瓜子提取物的制备取波棱瓜子500g，碎成粗粉，加10倍80%乙醇回流提取，重复两次，每次2h，合并滤液，减压浓缩至2g生药/ml，浓缩液离心，分去油层和水层，沉淀用石油醚脱脂，直至石油醚无色，沉淀物常温挥至无石油醚，浓缩干燥，得提取物粉末50g，用蒸馏水稀释至指定浓度的混悬液，备用。2.2统计学处理采用SPSS17.0进行统计分析，数据以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。2.3抗疲劳游泳实验[3]健康小鼠40只，雌雄各半，体质量18～22g，随机分为空白对照组(给予等容量0.9%NaCl溶液)、复方丹参组(0.84g/kg)、波棱低剂量组(1g/kg)、波棱中低剂量组(2g/kg)，波棱高剂量组(4g/kg)，每组8只，每日ig两次（各组小鼠日服用体积均为1ml），连续7天，在末次给药1h后将小鼠放入水深14cm的游泳槽内，水浴温度(16±1℃),让其不断连续游泳,记录每只小鼠头部全部入水8s不能浮出水面时间。结果见表1。表1波棱瓜子提取物对小鼠疲劳游泳时间的影响(x±s)组别剂量（g/kg）动物数（只）游泳时间（min）空白对照组—835.17±7.73复方丹参片组0.84862.00±18.27b波棱低剂量组1857.33±21.53a波棱中剂量组2865.50±14.30b波棱高剂量组4872.83±6.82b注：与空白组比较，aP0.05，bP0.01由表1可知，复方丹参片组、波棱高、中、低剂量组游泳时间与空白对照组比较均有显著性差异（P0.05），各给药组间差异无统计学意义（P0.05）。2.4常压密闭耐缺氧实验[3-4]健康小鼠40只，雌雄各半，体质量18～22g，随机分为空白对照组(给予等容量0.9%NaCl溶液)、复方丹参组0.84g/kg、波棱低剂量组(1g/kg)、波棱中低剂量组(2g/kg)、波棱高剂量组(4g/kg)，每组8只，每日ig两次（各组小鼠日服用体积均为1ml），连续7天，在末次给药1h后将各组小鼠分别放入盛有10g钠石灰的250ml磨口瓶中(每瓶1只)，用凡士林瓶口密封，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠因缺氧而死亡的时间。结果见表2。表2波棱瓜子提取物对小鼠耐缺氧存活时间的影响(x±s)组别剂量（g/kg）动物数（只）耐缺氧存活时间（min）空白对照组—813.14±0.82复方丹参片组0.84812.76±1.07波棱低剂量组1814.28±1.15波棱中剂量组2815.19±1.21b波棱高剂量组4816.00±1.00b注：与空白组比较，aP0.05，bP0.01由表2知，波棱高、中剂量组耐缺氧存活时间与空白组比较有显著性差异（P0.01），复方丹参片组、波棱低剂量组与空白组之间差异无统计学意义（P0.05）。3讨论第5届国际运动生化学术会议将疲劳(Fatigue)定义为由机体运动本身所引起的机体生理过程不能持续维持其功能在特定水平和(或)不能维持预定的运动强度的机体运动能力下降的现象[5]。从西方医学观点来看，对于疲劳产生的机制主要有以下几种假说：能源“耗竭”学说、疲劳物质“堵塞”学说、机内环境“突变”学说和中枢神经失调学说。本实验结果显示，波棱高、中、低剂量组的抗疲劳游泳时间与空白对照组相比均有显著差异，证明波棱瓜子有较好的抗疲劳作用。波棱瓜子含有苯并呋喃木脂素、氨基酸、蛋白质、多肽、脂肪油、鞣质、酚类等成分[6]。针对西方医学的疲劳假说，根据波棱瓜子的化学物质基础，推测其抗疲劳的机制可能为以下两点：（1)氨基酸、蛋白质、多肽等直接提供能源物质，维持体内正常蛋白质合成，减缓由运动引发的体内蛋白质的分解，减轻其对机体产生的损害，达到抗疲劳的效果；（2）木脂素及其他酚类物质能够加速清除氧自由基且具有较强的抗脂质氧化作用[7-8]，降低无氧代谢产物水平。缺氧(hypoxia)是指组织得不到充足的氧，或不能充分利用氧时，组织的代谢、机能、甚至形态结构发生异常变化的病理过程。常压密闭耐缺氧实验表明，波棱瓜子提取物能显著延长小鼠耐缺氧存活时间，具有较好的耐缺氧功效。波棱瓜子生长于高原地区，长期处于低氧环境，可能本身具有耐缺氧作用，其具体作用机制与其抗疲劳作用密不可分，可能与增加SOD活性、抑制脂质过氧化反应、加速消除氧自由基等有关[9]，其作用机制还在进一步研究当中。研究开发抗疲劳和耐缺氧的药物，提高部队战斗力，减少非战斗减员，一直是军事医学的热点，也是当今处于高压工作状态的社会大众的迫切需要。藏药波棱瓜子的抗疲劳耐缺氧作用仍需进一步深入研究，为开发抗疲劳耐缺氧新药提供实验依据。［参考文献］[1]丛龙波,王琪,李仙逸,等.藏药波棱瓜子抗肝炎药效物质基础研究[J].医学研究杂志,2007,36(8):75-76[2]鞠宝兆.中药抗疲劳机制及方药的筛选规律[J].中国临床康复,2004,8(18):3656-3657[3]徐叔方,卞如濂,陈修,等.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2001.1510-1512[4]景冬樱,卞俊,陆波,活力胶囊耐缺氧抗疲劳和延缓衰老实验研究[J].解放军药学学报,2007,23(5):335-337[5]黄林章,黄宝康,秦路平,等.中药抗疲劳作用机制的研究进展[J].现代药物与临床,2010,25(3):161-165[6]Long-boCong,Hai-longYuan,QiWang,etal.SimultaneousdeterminationofsevenbioactivelignansinHerpetospermumcaudigerumbyRP-HPLCmethod[J].Biomed.Chromatogr,2008,22:1084–1090[7]方清茂,张浩,曹毓,等.藏药波棱瓜子提取物对肝损伤大鼠的抗氧化作用[J].华西药学杂志,2008,23(2):147-149[8]WangLY,UneharaN,