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编号学士学位论文泽普油田石油降解菌株的初步研究学生姓名：崔楠学号：20070306006系部：生命与环境科学系专业：环境科学年级：2007指导教师：易霞完成日期：2011年5月3日学士学位论文BACHELOR’STHESIS中文摘要基于稀释平板涂布法、生理生化实验和溶血实验，本研究从泽普油田土壤中分离和初步鉴定了1株石油降解细菌。同时，本研究通过紫外光谱和HPLC对原油发酵培养的石油降解菌株进行了降解能力的分析。结果表明，分离到的石油降解菌株对原油有一定的降解能力。因此，本研究将对泽普油田，乃至新疆其他油田残留石油的生物去除提供理论依据，同时也将推动该地区基础和有用微生物的研究和开发。关键词：泽普油田；石油降解菌株；紫外光谱；HPLCThePrimaryStudyofPetroleum-degradingIsolatesofZepuOilFieldAbstractBasedonthemethodofdilutingandplating,physiologicalandbiochemicalexperimentandhemolysistest,itscreenedandidentifiedanoil-degradingisolatefromsoilinZepuoil-field.Meanwhile,itstudiedthecapacityofoil-degradingusingfermentingmediumbytheisolatebyultravioletspectrumandhigh-performanceliquidchromatography.Itshowedthattheisolatecoulddegradecrudeoil.So,itwouldprovidethetheoreticalbasisforbiologicalremovalforZepuoil-fieldandotherones.Anditalsowouldpromotethefundermentalstudyandthestudyandexplorationoftheusefulmicroorganism.Keywords:Zepuoil-field;Petroleum-degradingisolate;Ultravioletspectrum;High-performanceliquidchromatography.学士学位论文BACHELOR’STHESIS2目录中文摘要...........................................................1ABSTRACT...........................................................1引言...............................................................22材料和方法.......................................................42.1材料...........................................................42.1.1样品来源......................................................42.1.2培养基.......................................................42.1.3实验仪器......................................................42.2方法...........................................................52.2.1采样.........................................................52.2.2分离方法.....................................................52.2.3微生物的培养.................................................62.2.4石油降解菌株的形态学观察.....................................62.2.5溶血实验......................................................62.2.6排油圈法.....................................................62.2.7原油黏度的测定...............................................62.2.8原油降解产物的紫外光谱分析...................................82.2.9原油降解产物的HPLC分析......................................83结果与讨论.......................................................93.1石油降解菌株分离的鉴定.........................................93.2溶血实验.......................................................93.3排油圈检测.....................................................93.4原油黏度测定...................................................93.5降解产物的紫外光谱检测.........................................103.6降解产物的HPLC检测...........................................124展望............................................................15参考文献..........................................................15附录..............................................................17致谢..............................................................18学士学位论文BACHELOR’STHESIS2引言随着经济和社会的迅速发展，石油及其制品广泛地应用于国民经济的各个领域和人类的日常生活中，油类在开采、储存、运输、加工和应用过程中的泄漏和排放对环境的污染也日趋严重。石油进入水体会对水环境造成严重污染。目前在石油污染的治理中，采取的技术有物理、化学和生物方法。用物理方法很难去除表面油膜和水中溶解的油。而化学法实际是向水体中加入化学试剂，存在二次污染。微生物方法可去除表面油膜和水中溶解的油，且费用相对于物理法和化学法低，被公认为是安全、有效、成本低廉的方法，具有广阔的前景。随着现代石油工业的发展，石油的环境污染问题越来越突出，微生物修复技术被公认为是治理石油污染的较好方法，研究发现获得高效、广谱、稳定、适应性强的石油降解菌株以及配套治理工艺是利用该技术进行石油污染的较好方法。生物降解国外开展的比较早。最早的是1964年美国海洋微生物学家Zobell，利用浓度为1.0g/100cm3原油和润滑油进行海洋细菌降解石油烃速率研究，结果显示在添加氮和磷营养盐条件下降解速率为4.00×10-13-3.18×10-11mg/(cell·h)[1]。此后，国外的研究工作者大量开展了除油微生物种类多样性的研究。许多能降解石油烃的细菌、放线菌株、真菌被分离和鉴定出来。在石油烃的代谢机理方面，1978年，Ratledg就土壤中微生物对烷烃的利用以及烃的代谢作用等方面作了综述[2]。1979年，Aurich总结了烷烃细菌代谢作用的生物化学过程[3]。1981年，Rehm和Reiff广泛总结了土壤中各种烷烃代谢作用的产物[4]。近年来该领域的研究工作主要集中于修复技术的开发和影响因素优化方面。1992年，Hogg等在新西兰成功地就用生物通风技术对含有有机污染物的土壤进行了修复，土壤中石油的浓度减少了92%[5]。1997年，Sugiura等研究了菌株Acinetobactersp.T4，8mS在不同温度下对四种原油降解的影响，20℃时对阿拉伯轻油、Dubai原油、Shengai原油、Maya原油的降解率分别为20-34%，14-27%，14-25%，12-19%[6]。我国对石油污染的微生物降解研究较晚。但随着我国石油工业的发展，受石油污染的土地面积不断扩大，污染程度也日趋严重。为此我国的科研工作者也开展了大量的研究工作。2001年何良菊等利用从辽河油田分离出石油烃降解学士学位论文BACHELOR’STHESIS3菌，采用生物泥浆法，研究了土壤中石油烃污染物生物降解过程中营养物质供给的平衡关系及其影响降解的机理[7]。2005年，武汉大学郑金秀等从石油化工厂附近的污染土壤中分离到三株石油降解菌w1、w2和w3；并将w1和w2进行紫外诱变得到诱变菌，对诱变前后的菌株进行石油降解实验，结果表明，诱变前的菌株在原油浓度为4000mg/L培养液中培养10d，原油的降解率分别为74.34％和77.58％。而诱变菌株10d降解率达到了79.9%和87.3%。同时，诱变菌株还大大提高了菌株对高浓度石油的耐受能力[8]。2006年。天津科技大学田胜艳等，从天津临港工业区潮间带筛选分离出17株石油烃降解菌对柴油和芳香族化合物具有降解作用[9]。自然界中就存在着多种石油降解微生物。目前，已报道诸如rhodococcusrhodochrous,pseudomonas,alicaligenes,rhodococcuserythropolis,acinetobacter,devouroil等能够降解原油的菌种，VecchioliGI报道了通过添加土著微生物增强石油降解的能力。石油的开采和海上运输业的发展，使石油泄漏事故逐年增多，受污染的海域范围不断扩展。自1969年发生第一次超级油船失事以来，世界上已有超过40处大的海洋泄漏，据估计每年都有千万公吨以上的石油污染世界海洋，对生物和生态环境造成了很大危害。石油污染日益严重，石油类物质进入土壤后，改变了土壤的有机质的组成和结构，从而影响了土壤微生物的生长和生长繁殖，引起土壤微生物群落、微生物区系的变化，大量的石油不仅堵塞土壤结构孔隙，对微生物有抑制作用，阻碍了土壤微生物活性。石油进入水体，不仅污染水体，而且通过食物链会危害到人类的健康。石油污染问题引起了人们越来越多的关注，对之进行治理也成为了最迫切的事情。在治理中产生的生物降解方法的研究虽仍有很大争论,但也已取得了一些成果，而且有种趋势是天然微生物的生物降解作用已成为消除环境中石油烃类污染的主要机制。泽普石油化工厂工程是“七五”期间国家重点扶贫工程，是新疆维吾尔自治区二级企业，是一座现代化程度很高的石油化工中型联合企业。主要产品有原油、天然气年产5亿m3，化肥年生产能力50万t，原油年加工能力2005年将达到50t。但是，泽普油田在很大程度上存在石油对大气和土壤的污染。目前，对新疆泽普油田微生物和石油降解菌株的研究尚属空白。本研究基于稀释平板涂布法、生理生化实验、溶血试验，本研究对泽普油田土样中的原油学士学位论文BACHELOR’STHESIS4降解微生物进行分离和初步鉴定。同时，本研究还通过紫外光谱法和HPLC对原油发酵培养的原油降解菌株进行