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流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量至少1ml。2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。4．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV2％灵敏度500—1000个荧光素分子参考值(百分数（绝对值）)CD3+60.8-75.4%(1141-1880)CD4+29.4-45.8%(478-1072)CD8+18.2-32.8%(393-742)NK9.5-23.5%(175-567)Th/Ts1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。方案（Protocol）HLA-B27测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：HLA-B27测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量至少1ml。2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。4．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性操作性能精密度批内五次重复CV2％灵敏度500—1000个荧光素分子参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。方案（Protocol）CD55/CD59测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：CD55/CD59测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量至少1ml。2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备:(一)白细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2．溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3．离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4．洗涤离心5．上机测样(二)红细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2．分别加入CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul。3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。4．洗涤离心。5．混匀、上机测样。报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV2％灵敏度500—1000个荧光素分子参考值CD5597%CD5997%PNH的临界值：RBCCD5995%WBCCD5990%PNH的诊断值：RBCCD5991%大部分80%中性粒细胞CD5984%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（Protocol）血小板膜表面抗体测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共2页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：血小板膜表面抗体测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量至少1ml。2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若450×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。4．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存联科成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra操作：富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3)分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)4)分别向试管中加入准备好的10u1含