流感病毒的分离鉴定(二)

实验十流感病毒的分离鉴定（二）1、血细胞凝集实验2、血细胞凝集抑制试验目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象，即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用，借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。实验材料(1)接种流感病毒的鸡胚。(2)质量分数为0．5％的鸡红细胞悬液。(3)流感病毒型与亚型免疫血清。(4)碘酒，酒精消毒棉球。(5)灭菌的镊子、剪刀。(6)无菌小试管，毛细滴管，吸管。(7)生理盐水。(8)试管、试管架。实验方法：1、血细胞凝集实验(1)收获尿囊液：鸡胚孵育3d后,放4度冰箱过夜,次日取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管中。(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。(3)取10支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管中，混匀后，再吸出0．2mL加入第2个试管中；混匀后，从第2个试管吸出0．2mL加入第3个试管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理盐水对照管。(5)稀释完毕后加人体积分数为0．5％的压积鸡红细胞悬液，每管0．2mL,室温放置30~60mn。流感病毒血凝试验试管号12345678910生理盐水0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2病毒液(1:10)0.20.20.20.20.20.20.20.20.2弃0.2病毒稀释度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120对照0.5%鸡红细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2摇匀置室温60～90分钟结果++++++++++++++++++++－－－㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦㈧㈨㈩→→→→→→→→→试管号12345678910生理盐水0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2病毒液(1:10)0.20.20.20.20.20.20.20.20.2弃0.2病毒稀释度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120对照0.5%鸡红细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2摇匀置室温60～90分钟结果++++++++++++++++++++－－－(6)结果观察观察时要轻拿、勿摇，首先观察对照管应无凝集，然后再观察试验管，各管出现的凝集程度以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“—”表示，判断标准如下：“++++”：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐。“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。“—”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。凝集效价：能使红细胞呈“++”凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。如表，第6个试管为“++”，且病毒稀释度最高，则该病毒悬液效价为1:640，即该病毒悬液稀释到1：640时，每0．2mL中含有一个血凝单位，配制4个血凝单位的病毒悬液时，病毒液应稀释成(1：640)X4，即1：160。2、血细胞凝集抑制试验试管1待测2待测3血清对照4抗原对照5红细胞对照生理盐水1：5血清4u病毒液0.5％鸡红细胞－0.20.20.2－0.20.20.20.20.2－0.20.2－0.20.20.4－－0.2按表加入材料和试剂结果观察先观察3支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红细胞对照不发生凝集，再观察试验管。血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该血清的抑制效价。鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有诊断意义。