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刘永安1,2，潘彬荣1,2，岳高红1,2，梅喜雪2，许立奎1,2，张宗宸1,2，周志辉1,2（1.浙南作物育种重点实验室温，浙江温州325006；2.温州市农业科学研究院，浙江温州325006）摘要：为克服从小麦叶片提取DNA用于PCR受季节的限制以及氯仿不易购买等问题，研究以从叶片中提取的以及用氯仿从小麦籽粒中提取的DNA为对照，用无氯仿方法提取小麦籽粒中的DNA，并用多重PCR进行检测。结果表明，用无氯仿方法提取的DNA浓度比从叶片中提取的和用氯仿提取的DNA浓度要低，而且用无氯仿方法提取的DNA扩增效果稍差，但该问题可通过增加上样量或采用聚丙稀酰胺凝胶电泳等途径来解决。因此，无氯仿小麦籽粒DNA提取方法可在对DNA质量要求不高以及氯仿无法及时得到时使用。关键词：小麦；半籽粒；DNA提取；氯仿中图分类号：Q781文献标识码：A文章编号：1006-060X（2014）24-0001-02收稿日期：2014-10-30基金项目：浙江省旱作粮油科技创新团队项目（2011R50026-13）；浙江省重大科技专项农业项目（2012C12902-2-3）；温州市种子种苗科技创新专项（N20120023）作者简介：刘永安（1980-），男，河南太康县人，讲师，主要从事小麦、甜玉米遗传育种研究。通讯作者：许立奎分子标记是研究小麦遗传和育种的重要技术手段，既可以研究小麦种质资源的遗传多样性，又可以对农艺性状进行辅助选择，具有不受时间限制、针对性强、效率高等优点。通常，用于分子标记的DNA是从小麦的幼叶中提取的。在研究过程中，虽然可以随时萌发种子获取幼叶用以提取DNA，但小麦的生长受一定季节的限制。如果没有温室等设施，在不适宜小麦播种的季节进行分子标记辅助选择，选择出的目标植株将不能正常生长，甚至不能获得种子，而这些设施正是一些基层科研单位所缺少的。而从远离小麦胚的半粒种子中提取DNA是解决该问题的有效途径。从半粒种子中提取的DNA用于分子标记，剩下的半粒种子可适时播种，不需借助温室等设施。目前，小麦种子DNA的提取已有较多报道[1-2]。在提取的过程中，通常会用到苯酚、氯仿、异戊醇等试剂。然而，氯仿受公安部门管制，购买时需要公安部门审批[3]，对一些基层科研单位，购买氯仿不但相对困难，而且还比较费时。因此，研究尝试探索一种不用氯仿的小麦籽粒DNA提取的简单方法，以便为基层科研单位进行小麦分子标记提供技术支持。1材料与方法1.1试验材料以含有Pm21基因的扬麦18为研究对象，该材料从江苏省里下河地区农业科学院引进。主要试验试剂有Tris、浓盐酸、EDTA、SDS、NaCl、乙醇、醋酸铵等，以上试剂均为分析纯。1.2试验方法1.2.1小麦幼叶DNA提取参考柴建芳等[4]的方法提取，但最后不加RNA酶，该法提取的DNA作为从籽粒提取DNA的对照。1.2.2有氯仿小麦籽粒DNA提取参考董建力等的方法进行提取，该法提取的DNA作为无氯仿小麦籽粒提取DNA的对照。1.2.3无氯仿小麦籽粒DNA提取用刀片切取半粒小麦种子（有胚和无胚），置于1张干净称量纸上，将称量纸对折以便使小麦籽粒留于中间；用研棒将籽粒研碎，移于1.5mL离心管中；加入700μLDNA提取缓冲液（100mmol/LTris·HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，2%SDS），65℃水浴约30min，其间摇匀数次；冷却至室温，于4℃下13000rpm离心15min；取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95%乙醇，上下颠倒7~8次，于4℃下13000rpm离心10min；弃上清液，加入500μL70%乙醇，上下颠倒7~8次，于4℃下13000rpm离心2min；弃上清液，于37℃恒温箱中干燥1h；加50μLTE缓冲液溶解DNA。1.2.4DNA质量检查取2μLDNA样品与1μL6×DNALoadingBuffer混合，于1%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳15min检查DNA质量。1.2.5PCR检测用多重PCR检测扬麦18的3个Wx蛋白亚基（Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1）基因和抗白粉病基因Pm21，其反应体系及扩增条件参考许立奎等[5]的方法，引物序列及预扩增条带见表1。2结果与分析2.1DNA质量检测由图1可知，3种提取方法都能得到DNA条带，但不同方法所取得的DNA量有所不同，从叶片中提取的和用氯仿提取的DNA浓度较高，没有用氯仿提取的DNA浓度较低。同时，有研究表明不同提取方法和小麦籽粒不同部位提取RNA的浓度有显著差异，从叶片中提取的和从有胚半粒小麦种子中提取的RNA的浓度较高，从无胚半粒小麦种子提取RNA的浓度较低。另外，从叶片中提取的RNA片段较小，用有氯仿方法从有胚半粒种子提取的RNA片段较大，而用无氯仿方法从有胚半粒种子提取RNA片段呈现较为均匀的弥散状态。2.2多重PCR检测如图2所示，用各种方法提取的DNA进行扩增，基本都能得到目标条带Wx-D1（204bp）、Wx-A1（265bp）、Wx-B1（854bp）和Pm21（1400bp），但其多重PCR结果有明显差异，主要表现在目标条带Wx-D1（204bp）和Pm21（1400bp）亮度的差异。从叶片中提取的DNA扩增效果最好，各目标条带都较亮；用氯仿提取的半粒种子DNA扩增效果稍差，泳道2（有氯仿有胚半粒提取DNA）的Wx-D1（204bp）条带不明显；没有用氯仿提取的半粒种子的DNA扩增效果也较差，从有胚和无胚半粒种子提取DNA扩增的Pm21（1400bp）都较暗，这可能与模板DNA浓度较低有关。3讨论研究所用的无氯仿小麦籽粒DNA提取方法，与以前的研究相比，所需试剂没有氯仿，操作步骤少了“氯仿-异戊醇或苯酚-氯仿-异戊醇抽提”这一环节，具有所需试验试剂容易获取、操作步骤简单快捷等优点。与传统的氯仿提取方法相比，虽然该方法所得的DNA浓度较低，但一样可用作PCR扩增模板。该研究用多重PCR进行检测，与一般PCR相比，具有所需试剂少、通量高、经济等优点[9]，但也存在对模板DNA质量要求高、引物设计困难、不同扩增片段存在竞争等问题[10]。用无氯仿提取法所得到DNA为模板，可扩增出所有目标条带，说明该DNA提取方法具有较好的实用性。不过，用该方法提取的DNA为模板，所扩增出的Pm21（1400bp）条带较暗，需增加上样量或用聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，以得到更为理想的效果。因此，无氯仿小麦籽粒DNA提取方法可在对DNA质量要求不高以及氯仿无法及时得到时使用，尤其适合基层科研单位使用。参考文献：[1]董建力，张增艳，王敬东，等.用于PCR分析的小麦种子DNA微量快速提取[J].种子，2007，26（5）：10-12.[2]任强，张增艳，黄鹏.半粒小麦种子DNA提取的研究[J].甘肃农业大学学报，2010，45（4）：59-62.[3]苗翠英，张晶.论走私、贩卖易制毒化学品案件的特点及防范对策[J].公安大学学报，2002，（1）：92-96.[4]柴建芳，刘旭，贾继增.一种适于PCR扩增的小麦基因组DNA快速提取法[J].植物遗传资源学报，2006，7（2）：246-248.[5]许立奎，潘彬荣，岳高红，等.抗白粉病糯性小麦的多重PCR分子鉴定技术[J].核农学报，2014，28（7）：1203-1207.[6]ShariflouMR，SharpPJ.Apolymorphicmicrosatelliteinthe3’endof‘waxy’genesofwheat，Triticumaestivum[J].PlantBreeding，1999，118（3）：275-277.[7]刘迎春.小麦Wx基因的分子标记及其应用[D].南京：南京农业大学，2004.[8]LiuZ，SunQ，NiZ，etal.DevelopmentofSCARmarkerslinkedtothePm21geneconferringresistancetopowderymildewincommonwheat[J].PlantBreeding，1999，118（3）：215-219.[9]陈明洁，方倜，柯涛，等.多重PCR——一种高效快速的分子生物学技术[J].武汉理工大学学报，2005，27（10）：33-36.[10]黄银花，胡晓湘，徐慰倬，等.影响多重PCR扩增效果的因素[J].遗传，2003，25（1）：65-68.（责任编辑：成平）