无选择标记转基因技术研究进展

无选择标记转基因技术研究进展摘要随着转基因技术的诞生，转基因植物中选择标记基因的安全性已受到了广泛的关注，如何培育无选择标记基因转基因植物已成为基因工程研究的重点。在植物基因转移过程中，筛选标记基因常被用于筛选转化细胞或组织，给转基因工作带来很大方便。但在获得转基因植物之后，筛选标记基因的表达往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响，且不利于使用相同标记基因进行多重转化。为了消除这些弊端，一种全新的发展策略即获得无选择标记转基因植物应运而生。文章主要综述获得无选择标记转基因植物的方法。关键词无选择标记转基因植物Abstract：withthedevelopmentoftransgeniccrops，thesecurityofselectablemakergeneintransgeniccropshasbeenconcernedextensively,andhowtoculturetheselectablemaker-freetransgenicplantshasbecometheemphasisoftransgenicengineering.Selectivemarkergeneisusuallyusedtoselecttransformedcellsortissueduringgenetransfer.However,theuseofitisharmfultoenvironment,plantdevelopmentandaffectsmulti-transformation.Anewstrategythatoffersaapproachfortheeliminationofthosedisadvantagescausedbytheselectablemarkergeneisdevelop.Wesummarizedsomemethodsofcorrelativemakergenes’removal.Keyword:Selectablemarker-free;Transgenic;Plant前言转基因植物的安全性已经引起了社会的普遍关注与争论，因为在植物的遗传转化过程中需要借助选择标记基因的功能筛选转化体。而选择标记基因一般是一些抗生素抗性基因和抗除草剂基因，这些基因在转化成功后会长期存在于转基因植物中。因此，对转基因技术持反对态度的学者担心。第一，人们在食用了转基因产品后，抗性标记基因是否会水平转移到肠道微生物体内或上皮细胞中，从而降低抗生素在临床中的有效性。第二，标记基因可能会转移到杂草和其他物种上而产生所谓“超级杂草”和超级病虫害或打破原有生态平衡，造成生态失衡。对于转基因技术本身而言，标记基因与目的基因一般由同一种启动子驱动，它的存在可能会导致目的基因的沉默或失活。而且转基因过程中所用的标记基因数量有限，由于标记基因的存在，若要对已转化的植株进行再转化，筛选也是一个困难。标记基因的存在增加了转基因植物基因组的大小，不利于转基因植物的遗传稳定性。由此可见，选择标记基因的存在严重地阻碍了转基因植物的商品化进程和转化技术本身的有效性。因此，怎样培育无选择标记转基因作物已成为近年来植物基因工程研究的重点之一。迄今已有多种方法应用于无选择标记转基因植物的培育上。1位点特异性重组系统位点特异性重组系统是利用重组酶催化两个短的特定NDA序列间的重组，来消除选择标记基因，以获得无选择标记的转基因植物。Cre/loxP位点特异性重组系统是从大肠杆菌噬菌体P1中获得的,它包括2个组件,重组酶(Cre)和重组位点(loxP)。Cre酶引发重组事件并引起相邻2个loxP位点之间NDA片段的切除。该方法主要包括以下3个步骤：①通过含有选择标记基因（selectablemarkergenes,SMG）和两侧均有loxP的目的基因(geneofinterest,GOI)的双元载体(GOI/lox/SMG/lox)转化获得转基因植株。②通过再转化或杂交授粉向转基因植株导入Cre基因（与另一个标记基因相连）；③植物基因组中切除两侧均有loxP的SMG或通过杂交将GOI与Cre基因分离[2]转座子介导的再定位这一方法是借助于转座子系统如玉米的Ac/Ds、Spm/dSpm的转座作用。利用转基因植物与非转基因植物的杂交以及子代的分子分析即可以获得无标记基因的后代植株[3]。理论上认为，转基因植物中只含有目的基因和转座因子的末端重复序列，其它所有的用于转化和转座的NDA都被消除，如T-NDA标记基因和转座酶。但是，因为大多数被修饰过的转座因子切除后又重新插入基因组中的其他位置，只有那些发生了转座失误的细胞才能形成表型正常的转基因苗，当转座频率很低时需要大量的筛选工作。2选择标记基因的组织特异性表达理论上，用一个能在时间或空间上起控制作用的特异启动子来调控选择标记基因在转化位点的表达是可能的。在这种情况下，有可能在成熟植株中获得不表达选择标记基因的转化体，从药用植物石刁柏中分离的创伤诱导表达的启动子Ao-PR1是一个很好的例子，由它启动的nptII基因在烟草叶盘的愈伤组织充分表达,因此能有效地筛选转化细胞；而在成熟叶片组织中nptII表达很少或根本检测不到它的表达。3同源重组该方法是将标记基因置于重复序列之间，通过重复序列的同源重组作用将标记基因切除。些重复序列可以是转基因卡盒的任何部分，如启动子、终止信号等。噬菌体利用噬菌体附着位点(attP)整合在大肠杆菌基因组的细菌附着位点(attB)上。arrP整合需要噬菌体编码的整合酶(int)及细菌整合宿主因子(IHF)。Zubko[5]报道了在两个attP位点应用染色体内同源重组消除选择标记基因。不带有INT及IHF蛋白的转化体系[5]他们的研究结果表明，通过染色体内重组及两步再生，可获得无选择标记的转基因植株。4农杆菌介导的共转化同时使用两个独立的NDA载体对植物进行转化，一个含有目的基因，一个含有选择标记基因，如果两基因整合到完全非连锁位点，通过杂交目的基因就能在下一代中与选择标记基因分离，即可获得MFTPs[4,6]，这个系统必须符合两个原则：a.共转化频率要高;b.共转化的NDA在受体细胞中处于不连锁状态。共转化根据所使用的方法不同可分为以下3种①2质粒/2菌株法，即共转化是通过与两个农杆菌菌株共培养完成的，在两个不同的双元质粒上分别含有一个选择标记基因及一个目的基因。通过选择标记基因来进行转化植株的筛选，然后通过杂交从共转化植株中分离无选择标记的转基因植株。DeBlock[7]用两个农杆菌转化油菜,共转化频率达到60%-80%；②2质粒菌/1株方法，即共转化是通过与一个农杆菌菌株共培养完成的，该菌株含有两个不同的双元质粒，其上分别含有一个选择标记基因及一个目的基因。Daley[8]用该法证明了两个不同的T-DNA整合到非连锁位点，并获得了油菜和烟草的MFTP；③2T-DNA/1菌株方法，即共转化是通过与一个农杆菌菌株共培养完成的，该菌株含有一个双元质粒，在其不同的T-DNA上分别含有一个选择标记基因及一个目的基因。已有许多烟草和水稻的遗传转化使用了携带这种载体的农杆菌菌株LBA4404，两个T-DNA的共转化率在47%以上[9]，Depicker[10]实验结果表明，在独立侵染事件中，单一的细菌能够转移并整合两个独立的T-DNA而且植物细胞团从一个细菌获得的T-DNA比单细胞从几个细菌中获得的多。这一方法所产生的共转化后代中只有25%的植株标记基因和外源基因被分离。因此需要从大量的转植株中去筛选。另外，这一方法要求植物能进行有性生殖，不适合于马铃薯、甘蔗等无性繁殖植物的转化。而且，在使用基因枪转化中!两个DNA分子有时会发生共整合，不能有效地获得切除标记基因的植物。小结以上是目前培育无选择标记转基因植物的主要方法。其中同源重组法和位点特异性重组法是借助重组作用使标记基因缺失，达到切除标记基因的效果，而转座子和共转化法是将标记基因和外源基因整合在不同的位置上。两者在其后代的植株的减数分裂及受精的过程中可以被分开。从而可筛选到没有标记基因的安全的转基因作物中。这四种方法各有利弊，选择何种转化系统要视具体情况而定。总之，随着后基因组时代的到来，各种功能基因将被应用于植物的遗传转化中，而无选择标记转基因技术的发展将会消除转基因食品对人类健康和环境安全等方面造成的隐患，加速转基因作物的推广应用，造福人类。参考文献[1]刘爱秋,邓晓建,吴成,等.转基因作物的安全性问题及对策[J].中国农学报,2002,18(5);70-73.[2]BertollaF.SimonetP.Horizontalgenetransfersintheenvironment:naturaltransformationasaputativeprocessforgenetransfersbetweentransgenicplantsandmicroorganisms[J].ResMicrobiol,1999,15:375-384[3]ZubkoE,ScutC,MeyerP.IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes[J].NatBiotechnol,2000,18:442-445.[4]SauerB.Site-specificrecombination:developmentsandapplications[J].CurrOpinBiotechnol,1994,5:521-527.[5]刘峰,赵茵英,郑金贵,等.双农杆菌共转化获得无标记基因的水稻植株[J].应用与环境生物学报.2005,11(4):393-398.[6]张秀春,彭明,吴坤鑫,等.利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因大豆[J].大豆科学,2006,25(4):369-372.[7]GRAYMW.BURGERG,LANGBE.Mitochondrialevolution[J].Science,1999,283:1476-1481[8]高尚,贾红阁,陈晓英,等.选择标记可去除的植物高效表达载体的构建[J],生物工程学报,2007,23(1):157-160[9]DeBM,DebrouwerD.TwoT-NDAasco-transformedintoBrassicanapusbyadoubleAgrobacteriumtumefaciensinfectionaremainlyintegratedatthesamelocus[J].TheorApplGenet,1991,82:257-263[10]DepickerA,HermanL,JacobsA,etal.FrequenciesofsimultaneoustransformationwithdifferentT-DNAsandtheirrelevancetotheAgrobacterium/plantcellinteraction[J].MolGenGenet,1985,201:477-484.[11]SugitaK,MatsunagaE,EbinumaH.EffecfiveSelectionsystemforgeneratingmarker-freetransgenicplantsindependentofsecualcrossing[J].PlantCellReport,1999,18:941-947.[12]CuiM,TakayamagiK,KamadaHetal.EffcientshootregenerationfromhairyrootsofAntirrhinummajusL.transformedbytheroltypeMATvectorsystem[J].PlantCellReport,2001,20:55-59[13]CuiM,TakayamagiK,KamadaHetal.TransformationofAntirrhinummaju