柴胡茎叶总黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究

柴胡茎叶总黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究北柴胡(BupleurumchinenseDC.)为伞形科柴胡属植物,收载于中国药典,为药用柴胡的主要种源。柴胡具有驱散退热、舒肝生阳之功效,主治感冒发热、寒热往来、疟疾、胸肋胀痛、月经不调及子宫脱垂等症。现代药理研究证明柴胡具有解热、镇痛、镇静、抗炎、免疫增强、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用,具有极高的药用研究价值,黄酮类化合物在自然界分布广泛,具有抗氧化、抑菌消炎和抗衰老等功效。柴胡总黄酮具有较强的抗流感病毒作用,而且具有较好的抗炎、降温效果,对多种细胞有较强的抑制或杀灭作用。本文利用不同浓度的乙醇提取,通过正交试验确定北柴胡茎中总黄酮的最佳提取工艺条件为基础,对提取液进行大孔吸附树脂吸附分离性能研究，以期为柴胡茎叶总黄酮的提取分离提供依据。1材料与仪器1.1材料本品为伞形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC.）或狭叶柴胡（Bupleurumscorzoner-ifoliumWilld.）的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”及“南柴胡”。1.2试剂芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠和硝酸铝均为分析纯。1.3仪器电热恒温水浴锅(H·H·S21-6C，上海医疗器械五厂)；电子分析天平(FC204，上海精科实业有限公司)；UV-762紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；旋转蒸发器(上海亚蓉生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，索式提取器，电热鼓风干燥箱；植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)2方法2.1柴胡茎叶总黄酮的薄层检测硅胶薄板制作称取4g硅胶G置于研钵中，加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液12ml，研磨15min后铺于20×10cm的干净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。展开剂配制取展开剂氯仿：甲醇：水=7：2.5：0.5的比例配制100ml（70：25：5），取下层液作为展开剂。薄板活化：将制好的硅胶薄板在105℃下活化30min。点样：点样点距板子底端1.5cm左右，所有点样点位于同一直线上，尽可能向中间靠拢，每个点样点点样约20μl，点样点尽可能小。饱和：将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约0.5h。层析：将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约1.5cm时取出板子，自然晾干。观察：紫外灯(365nm)下观察,Rf:,层析图谱如下。展开取出晾干后在紫外灯(365nm)下观察，可见荧光、黄绿色荧光等4—6个斑点，主要为柴胡茎叶总黄酮各种甙及甙元，各斑点Rf在0.5以上分布。2.2紫外分光光度法测定柴胡茎叶总黄酮的含量2.2.1标准液的配制:精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品10mg,置50mL容量瓶中,用60%乙醇溶解并定容得到浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液。2.2.2标准曲线的绘制:精密量取标准溶液各0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于25mL容量瓶中,分别加60%乙醇溶液至10mL,再依次加入1mL5%亚硝酸钠溶液,摇匀,放置6min后加入1mL10%硝酸铝溶液,摇匀,放置6min后加入4%氢氧化钠溶液1mL,再加60%乙醇定容,摇匀,放置15min后在510nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标,芦丁浓度(mg/mL)为横坐标,制作标准曲线。得到回归方程Y=16·4125X-0·0105,R2=0·9998。2.2.3样品溶液的制备和黄酮含量的测定:准确称取阴干粉碎的北柴胡茎叶20g,按单因素实验和正交试验中不同的提取条件利用索氏提取器回流提取。提取液减压浓缩成膏状,用50mL温水充分溶解置于250mL分液漏斗,用等体积石油醚萃取3次以除去色素和部分脂溶性成分。水相合并后减压浓缩成膏状于60℃真空干燥箱中干燥至恒重,准确称取干燥粉末20mg用60%乙醇溶解并定容于10mL容量瓶中。依照“2.2.2”项下方法测定吸光度,代入回归方程中计算总黄酮的含量,并计算总黄酮的得率;总黄酮的得率(%)=(提取液中总黄酮浓度×提取液体积)/对应的原料重量×100%。在此过程中分别考察不同乙醇浓度、不同料液比、不同提取时间和温度对总黄酮提取的影响。然后结合正交试验确定最佳提取工艺。3柴胡茎叶总黄酮树脂吸附分离性能实验3.1大孔树脂静态吸附实验表1吸附树脂的物理性能型号极性比表面积/(m2/g)孔径/nmDM130D101AB-83.1.1树脂的处理和再生：将树脂放入95%乙醇浸泡24h，不断搅拌，用蒸馏水洗至无白色混浊，并且无醇味。在用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，然后用0.5moL/L的HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至中性，待用。树脂简单再生可用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，待用。经多次使用的树脂吸附杂质较多，颜色较深，可用酸碱反复处理再生后使用。3.1.2柴胡茎叶总黄酮溶液制备准确称取50.00g柴胡茎叶粉末置于圆底烧瓶中，加入75%乙醇300mL热回流提取2.0h，过滤，残渣在加入75%乙醇200mL热回流提取1.5h，过滤，残渣在加入75%乙醇200mL热回流提取1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加水稀释至500ml，次日过滤或离心得滤液，备用。3.1.3饱和吸附量的测定准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树脂1.00g于100ml三角瓶中，精密加入mg/ml的柴胡茎叶总黄酮溶液20.0ml，在25℃，120r/min的条件下振荡吸附18-24h，过滤，树脂用蒸馏水冲洗3遍，一并合入滤液中，用蒸馏水定容至50ml。测定吸附后溶液中总黄酮的量，并按下式计算树脂的饱和吸附量。静态饱和吸附量(mg/g)=加入的总黄酮量-未吸附的总黄酮量/树脂的量。3.1.4树脂脱附率的测定将上述经过18-24h静态吸附总黄酮的树脂分离出来，吸干表面水分，然后用75%的乙醇25.0ml，在25℃，120r/min的条件下振荡脱附2h，过滤，树脂用蒸馏水冲洗3遍，一并合入滤液中，用蒸馏水定容至50ml，测定脱附液中总黄酮的量，按下式计算脱附率。脱附率(%)=洗脱出的总黄酮量/(加入的总黄酮量-未吸附的总黄酮量)×100%。不同树脂对总黄酮的吸附量和解吸实验结果见表。表大孔树脂静态吸附及解吸性能型号吸附量/(mg/g)解吸率/%DM130D101AB-8从表可看到3种树脂中树脂的吸附量最大，树脂次之，最小，在实际生产应用中，对树脂要求不仅要求吸附量大，而且要求解吸率要高，以保证有效成分的最大回收。在这3种树脂中树脂不仅具有大的吸附量，而且具有较高的解吸率，因此认为树脂是富集纯化杜仲绿原酸较为理想的吸附材料。3.1.5pH对树脂吸附效果的影响准确称取预处理好的用滤纸吸干表面水份的湿树脂7份，每份1.0g，装入100mL具塞锥形瓶中，分别加入用2mol/L的盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH值的溶液20mL，在摇床上振摇18-24h，测定吸附后溶液中总黄酮的量。pH值3456789吸附量将表做图由图可以看出,pH值在-之间,树脂对总黄酮的吸附量是最大的,因为柴胡异黄酮类化合物分子中含有酚羟基、羧基,呈弱酸性,酸性化合物在酸性溶液中易吸附;此外,酸性条件下有利于葡萄糖苷型黄酮水解成苷元型,更容易被树脂所吸附。酸性太强,树脂的吸附性能会受到影响,吸附率下降;碱性增强,会使黄酮的亲水性增强,从而使吸附量下降。3.1.6大孔吸附树脂解吸特性的考察按3.1.3项的方法得到吸附饱和的树脂5份,分别精确加入25mL的10%、30%、50%、70%和90%的乙醇溶液进行解吸,计算不同浓度乙醇溶液对总黄酮的解吸率。选择洗脱剂不仅要求具有使大孔树脂溶胀，减弱被吸附物质与树脂之间的吸附力，而且要求可溶解被吸附物质，本实验选用洗脱剂为乙醇，考察不同乙醇溶液浓度对总异黄酮的解吸效果,结果见图1。洗脱剂浓度10%30%50%70%90%解吸率%将表做图图洗脱剂浓度对总异黄酮解吸的影响由图可以看出，10%和20%的洗脱液解吸率较低，而70%的洗脱液基本上可以将总黄酮完全从树脂上解吸下来，从纯化的纯度角度和节约试剂用量的角度考虑，应选用70%乙醇作为洗脱剂，没有必要使用90%的乙醇作为洗脱剂。3.2大孔树脂动态吸附实验3.2.1动态吸附透过曲线的测定吸附材料选取树脂，采用16mm×300mm的玻璃层析柱作为吸附柱，称取预处理好的树脂10g，湿法装柱，取柴胡茎叶总黄酮溶液（g/ml）200mL，用2mol/L的盐酸将总黄酮供试液调pH值为进行上样，上样流速控制在2—3mL/min，每20mL接一管，测定流出液中异黄酮浓度,绘制动态吸附透过曲线。流出液体积ml20406080100120流出液浓度mg/ml将表做图由图可以看出,当上样液体积达到mL时,原料液中总黄酮开始透过树脂柱,当体积达到mL时,树脂柱达到饱和吸附。3.2.2动态脱附解吸曲线测定称取预处理好的树脂10g，湿法装柱，用2mol/L的盐酸将总黄酮供试液调pH值为进行上样，上样流速控制在2—3mL/min，上样量为20mL，上样结束后用50mL的蒸馏水进行洗涤，以除去水溶性杂质，然后用75%的乙醇进行洗脱，每20mL接一管，测量流出液中总黄酮浓度，绘制动态脱附解吸线。洗脱剂体积ml20406080100流出液浓度mg/ml将表做图由图可以看出,用mL75%的乙醇进行洗脱,可基本上将异黄酮完全解吸下来,洗脱峰集中、对称,无明显拖尾现象,起到了很好的富集和回收的作用。3.2.2洗脱产物中总黄酮纯度的测定（由上述实验确定方案）分别用30%、70%和90%的乙醇作为洗脱剂，按前面的做法装柱、上样、洗脱，得到洗脱产物。精确吸取30%、70%和90%的乙醇洗脱液各50mL，水浴蒸干后，60℃真空干燥3h，得固形物，称重。按下式计算洗脱物中总黄酮的纯度。纯度(%)=总黄酮含量/固形物重量×100%洗脱溶剂解吸率%纯度%30%乙醇70%乙醇90%乙醇从表可看出,产物中异黄酮%乙醇解吸纯度较高,解吸率相对低一些。用树脂纯化前原液中总黄酮纯度为%,经树脂纯化后的解吸产物中总黄酮纯度为%,提高了倍，表明树脂对总黄酮起到了较好的富集、纯化作用。4结果与分析5结论