树脂法提取甘草中甘草苷的研究

ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ树脂法提取甘草中甘草苷的研究鱼红闪吴少杰金凤燮郭勇摘要主要研究了树脂法提取甘草中的甘草苷。结果表明：国产多孔树脂D101和日本产HP20树脂在水溶液中，对甘草苷的最大吸附量分别为238.7mg/g和278.9mg/g；吸附后的D101树脂和HP20树脂洗脱甘草苷的最佳乙醇浓度分别为50%和60%。甘草经粉碎、水浸、过滤、减压蒸馏、浓H2SO4沉淀等步骤，甘草苷粗品得率为9%以上，粗品再经D101树脂和HP20树脂处理，得甘草苷纯品，得率分别为60%和86%。关键词甘草甘草苷树脂柱IsolationandPurificationofGlycyrrhizinfromLicoricewithResinColumnYuHongshanWuShaojie*JinFengxie*GuoYong(CollegeofFoodandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,510641)*(DepartmentofFoodScience&Biotechnology,DalianInstituteofLightIndustry,Dalian，116001)ABSTRACTTheisolationandpurificationofglycyrrhizinfromlicoricewithresincolumnwerestudied.TheglycyrrhizinabsorptionamountontheD101andHP20resinwere238.7mg/gand278.9mg/g.Thegoodelutionconcentrationofethanolwas50%forD101resin,and60%forHP20resin.Thelicoricerootwasground,extractedbyhotwater,filtered,concentratedbyvacuumdistillation,precipitatedbytheH2SO4,anddriedtoabtain9%crudeglycyrrhizin.ThecrudeglycyrrhizinwaspurifiedbytheD101andHP20resin,thepurifiedglycyrrhizinwas60%forD101resincolumn,and86%fortheHP20resincolumn.Keywordlicorice,glycyrrhizin,resincolumn甘草（GlycyrrhizauralensisFisch）是豆科甘草属（Glycyrrhiza）植物，其根中的主要成分为甘草苷（glycyrrhizin，GL，又称甘草甜、甘草酸、甘草皂苷）和甘草次酸（glycyrrhetinicacid，GA，又称甘草皂苷元），结构式如图1［1］。甘草苷具有补脾益气、解毒保肝、润肺止咳、调和诸药的功效［2］。甘草苷又是食品高甜度的甜味剂和解毒剂，其甜度约为蔗糖的177倍［3］。甘草苷的甜味特点是缓慢而存留时间长，与蔗糖及柠檬酸搭配使用甜味更佳。甘草苷又具有很强的增香效能，用于乳制品、巧克力、可可、蛋制品及饮料效果很好,并具有解毒作用。也用于酱制品及腌渍食物等，已成为重要的食品添加剂。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ图1甘草苷和甘草次酸的结构甘草中的甘草苷一般以甘草苷单钾盐等无机盐的形式存在，传统制备高纯度的甘草苷，过程繁琐，使用大量有机溶剂，给工业化大批量生产带来一些困难。本文采用树脂法来提取高纯度的甘草苷，探讨了节约试剂的方法，为工业化大批量生产提供理论依据。1材料与方法1.1材料甘草产于新疆石河子地区;甘草苷标准品由日本池田糖化株式会社提供；D101树脂是天津农药总厂产品；HP20树脂是日本三菱化成产品；薄层层析板Silicagel60-F254是德国Merck产品；其他试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1香草醛-硫酸比色法测定甘草苷含量甘草苷含量用香草醛-硫酸比色法测定［4］。取0.25ml试样液加入0.25ml4.5%（W/V）香草醛溶液（4.5g香草醛溶于100ml80%乙醇溶液，临用前新鲜配制），置冰浴中，加入2.5ml78%（V/V）H2SO4溶液，混匀，在60℃水浴中加热20min，冰冷到室温，以0.25ml蒸馏水代替试样液为空白，在556nm处测定其吸收度。与上述步骤相同，以甘草苷标准品（溶于80%乙醇溶液）代替试样，并以0.25ml80%乙醇溶液代替试样液为空白，测定并绘出标准曲线。1.2.2树脂吸附容量的测定树脂对甘草苷的最大吸附容量的测定法为：取过量的10mg/ml的甘草苷溶液加入1g树脂，摇匀，于冰箱中放置3d，充分吸附后，利用香草醛-硫酸比色法分别测定吸附前及吸附后溶液中的甘草苷含量，计算其差值，便得树脂吸附容量。1.2.3树脂对甘草苷吸附和脱附条件树脂在装柱前用一定量水使其溶胀至体积不再增加为止，然后用95%乙醇湿法装柱（Ф1.8×10cm），俟树脂沉淀，过量乙醇从底部放出，加棉花少许轻压，并用蒸馏水洗去乙醇。上标准甘草苷溶液，分别用水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%（v/v）乙醇液梯度洗脱，流速为1ml/min，每3ml收集一管，利用香草醛-硫酸比色法测定每管溶液中的甘草苷含量并绘制洗脱曲线，取洗脱峰最高点及附近的试管做薄层层析检查。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ1.2.4薄层层析法（TLC法）甘草苷纯度用薄层层析法测定。薄层层析板在使用前需在110℃活化30～60min。点样量为10μl，展开剂：正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶2），展开约6cm，挥发干溶剂后，于254nm紫外分析仪中检测斑点。然后，喷洒10%H2SO4，在105℃下加热10min显色［1］。1.2.5离子对高效液相色谱法（RP-HPLC法）［5,6］甘草苷纯度也是用离子对高效液相色谱法测定的。高效液相色谱仪为日立638-50型，LC-UV型紫外检测仪。色谱柱为Nucleosil-C18，Φ4.6×150mm。流动相为10%TBAH（tetra-n-butylammoniumhydroxide，四丁基氢氧化铵水溶液）2.5ml加水70ml配成0.34%TBAH溶液，再以甲醇-0.34%TBAH（63∶35）为流动相，流速为1ml/min。检测波长为254nm，温度为室温。2结果与讨论2.1树脂吸附容量的测定树脂对甘草苷的最大吸附容量的测定法为：取过量的20mg/ml的甘草苷溶液10ml加入0.2～0.4g树脂，摇匀，于冰箱中放置3d，充分吸附后，利用香草醛-硫酸比色法分别测定吸附前及吸附后溶液中的甘草苷含量，计算其差值，便得树脂吸附容量，其结果如表1所示。表1两种型号多孔树脂的吸附容量吸附树脂型号吸附前甘草苷总含量（mg）吸附后甘草苷总含量（mg）吸附容量（mg/g）D101吸附树脂208.5141.7238.7HP20吸附树脂208.5106.6278.9从表1可以看到：HP20树脂对甘草苷的吸附明显优于D101树脂对甘草苷的吸附，吸附容量分别为278.9mg/g和238.7mg/g。2.2树脂法提取甘草苷洗脱条件的确定使D101树脂和HP20树脂吸附标准甘草苷后（远少于最大吸附容量），分别用水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇液梯度洗脱，以香草醛法测定洗脱液中甘草苷，其洗脱曲线如图2、3所示。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ图2D101吸附树脂洗脱甘草苷标准品的洗脱曲线注:流速为1ml/min,每试管接3ml;甘草苷含量用香草醛-硫酸比色法测定;由于用水、10%、20%、30%乙醇液洗脱时,甘草苷含量为零,因此图中没有绘出。■:40%乙醇液洗脱；●:50%乙醇液洗脱；▲:60%乙醇液洗脱乙醇液洗脱；◆:80%乙醇液洗脱。从图2中可以看到：对于D101树脂，用水、10%、20%、30%乙醇液洗脱时，甘草苷含量为零；40%乙醇液洗脱时有少量甘草苷洗出；在用50%和60%乙醇液洗脱时，大部分皂苷被洗脱，至70%和80%乙醇液洗脱时，已无甘草苷。图3HP20吸附树脂洗脱甘草苷标准品的洗脱曲线注：流速为1ml/min，每试管接3ml；甘草苷含量用香草醛-硫酸比色法测定；由于用水、10%、20%、30%和40%乙醇液洗脱时，甘草苷含量为零，因此图中没有绘出。■:50%乙醇液洗脱；●:60%乙醇液洗脱；▲:70%乙醇液洗脱；乙醇液洗脱。从图3中可以看到：对于HP20树脂，用水、10%、20%、30%、40%乙醇液洗脱时，甘草苷洗不下来；50%乙醇液洗脱时有少量甘草苷洗出；在用60%和70%ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ乙醇液洗脱时，大部分被洗脱，至80%乙醇液洗脱时已无甘草苷。取上述不同乙醇浓度洗脱时甘草苷含量最高值处的洗脱液，做薄层层析鉴定，结果与上述讨论相符。因此，确定在用D101树脂提取甘草苷时洗脱液为50%乙醇液，在用HP20吸附树脂提取甘草苷时洗脱液为60%乙醇液。2.3利用树脂法从甘草中提取纯甘草苷根据上面所确定的树脂对甘草苷的吸附与洗脱条件，探讨了利用树脂，从甘草中提取纯甘草苷的方法。将甘草样品粉碎，20目过筛。称取100g甘草粉，加入自来水，微沸1h，过滤，重复提取数次，合并水浸液，8000r/min离心除去沉淀（约得1000ml水浸液）；上述水浸液减压蒸馏至原体积的1/5（约得200ml水浸液），在搅拌下加入浓H2SO4直至棕色沉淀不再产生为止，取沉淀用水洗2次，置于50℃恒温箱中干燥2d，研碎后得甘草苷9.06g粗品。该甘草苷粗品做薄层层析（图4）鉴定，发现其中含有较多的杂质。图4D101吸附树脂不同乙醇浓度洗脱后薄层层析图谱注：点样量为10μl，展开剂为正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶2），喷洒10%H2SO4，在105℃下加热10min显色。1：甘草苷粗品；2：40%乙醇洗脱液；3：50%乙醇洗脱液；4：60%乙醇洗脱液；5：甘草苷标准品。取自制的甘草苷粗品各1g，制备溶液6份，分别用D101树脂柱和HP20树脂柱吸附。然后D101树脂用水、低浓度乙醇液洗脱，洗掉杂质；再分别用40%、50%和60%乙醇液洗脱甘草苷，用薄层层析和离子对高效液相色谱法测定其纯度，其结果如图4和图5所示。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ图5D101吸附树脂不同乙醇浓度洗脱后离子对高效液相色谱图注：色谱柱为Nucleosil-C18，Φ4.6mm×150mm。流动相为甲醇-0.34%TBAH（63∶35），流速1ml/min，检测波长254nm，温度为室温。A:甘草苷标准品；B:甘草苷粗品；C:40%乙醇洗脱液；D:50%乙醇洗脱液；E:60%乙醇洗脱液。从图4中中可以看到：40%和50%乙醇洗脱的甘草苷在薄层层析上为单点，但60%乙醇洗脱时有杂质；在离子对高效液相色谱法上40%和60%乙醇洗脱的甘草苷有杂质，50%乙醇洗脱的甘草苷无杂质。同样方法，HP20树脂柱吸附，然后用水、低浓度乙醇液洗脱，洗掉杂质；再分别用40%、50%和60%乙醇液洗脱甘草苷。50%和60%乙醇洗脱的甘草苷在薄层层析上为单点，但70%乙醇洗脱时有杂质；在离子对高效液相色谱法上70%乙醇洗脱的甘草苷有杂质，用50%和60%乙醇洗脱,洗脱的甘草苷无杂质。为了确甘草苷产品得率，吸附、洗杂质、过量的50%和60%乙醇洗脱D101树脂和HP20树脂柱，收集甘草苷洗脱液后，减压蒸馏并定容，用香草醛-硫酸比色法测定甘草苷含量，计算收率，分别为60%和86%，其纯度经薄层层析和离子对高效液相色谱分析，不逊色于日本产品。3结语如上所述，国产树脂D101和日本产HP20树脂的水溶液中，对甘草苷的最大吸附量分别为238.7mg/g和278.9mg/g；吸附后的D101树脂和HP20树脂洗脱甘草苷的最佳乙醇浓度分别为50%和60%。根据树脂性质，经甘草粉碎、水浸、过滤、减压蒸馏、浓H2SO4沉淀等步骤，甘草苷粗品得率为9%以上，粗品再经D101树