核桃树皮提取物对新生血管生成的影响

1核桃树皮提取物对新生血管生成的影响李佳，张洁雨，李岩*（北京理工大学生命科学与技术学院药学系，北京100081）摘要目的考察核桃树皮提取物(HT)对新生血管的抑制作用，并初步探讨可能的靶点和作用机制。方法体外采用MTT法考察核桃树皮提取物对人脐静脉细胞增殖、迁移和对肿瘤细胞黏附的影响。体内采用鸡胚尿囊膜法，考察核桃树皮提取物对新生血管的影响结果核桃树皮提取物可以明显抑制ECV304细胞的增殖和迁移，并且呈一定的浓度和作用时间的依赖性，同时也可以大大降低肿瘤细胞对ECV304的粘附能力，并且抑制CAM血管生成，使血管分支数明显减少。结论核桃树皮提取物可以抑制新生血管生成。关键词:核桃树皮有效成分血管生成CAMStudyontheeffectofJuglansmandshuricamaxinonAngiogenesisLIJia,ZHANGJie-yu,LIYan*(SchoolofLifescienceandTechnologyofBeijingInstituteofTechnology,Beijing,100081,China)Abstract:ObjectionTostudytheInhibitionofofJuglansmandshuricamaxim(HT)onangiogenesisMethodsTheeffectofHTonthegrowthofHumanumbilicalveincells(ECV304)andtheadhesionofHumanumbilicalveincellstotumorcellswereevaluatedbyMTT;checkedtheeffectofHTonangiogenesisbyEmbryoallantoicmembrane.ResultsHThadtheinhibitoryeffcctontheprolifcrationofECV304cells,reducethetumorcelladhesiontotheECV304,inhibitCAMangiogenesisandreducethenumberofbranches.ConclusionHTextractcaninhibitangiogenesis.Keywords:Walnuttreebarkactiveingredients;Angiogenesis;CAM血管新生(Angiogcncsis)是指在原有血管的基础上通过内皮细胞的增殖、迁移长出分支血管的过程。在生理情况下，血管新生在个体的发育以及伤口愈合作者简介：李佳（1981-），男，硕士研究生，主要从事中药抗肿瘤机理研究*通讯作者：李岩（1958-）女，教授，主要研究方向肿瘤、免疫药理学，新药药理学等研究。E-mail:[e-mail]:010-68912140。2中起着重要作用[1,2，3]。很多疾病的发展会导致血管新生异常，比如糖尿病、风湿性关节炎、肿瘤等。特别对少数实体瘤来说，血管新生是其进一步生长、转移的必要条件[3]。因此，抑制肿瘤血管新生过程成了抗肿瘤的主要内容之一。我们采用通过检测核桃树皮提取物(HT)对ECV304细胞的增殖、迁移和对肿瘤细胞黏附的作用，以及通过经典抗肿瘤血管生成的体内实验-鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成实验观察了HT对血管生成的抑制作用。1材料和方法1.1药品、试剂及仪器核桃树皮提取物(HT)核桃树皮有效成分本院药学系药学组提供。DMEM，批号：1019564GIBCO公司；小牛血清，杭州生物工程公司，批号：6008D；Trypsin，(1:250),AgaroseAmresco公司；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT，Amresco)；XDS-I倒置式光学显微镜（重庆光学仪器厂）；荧光显微镜LD5-2A型低速离心机北京医疗器械厂；MK3型酶标仪芬兰雷渤公司；XB-K-25型血细胞计数板玉环县求精医用仪器厂。1.2细胞培养人宫颈癌HeLa细胞：由北京师范大学生命科学与技术学院细胞室提供。人脐静脉内皮细胞ECV304：由军事医学科学院惠赠。以含10%小牛血清的DMEM常规培养，置于37℃、5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。1.3细胞增殖抑制检测1.3.1细胞毒实验(MTT法)[4]取对数生长期的HeLa细胞，台盼蓝排染法计数活细胞数，DMEM培养液调整细胞密度为1.0×106cells·l-1。以190μl·well-1，将细胞接种到96孔板中，细胞接种后置37℃，5%CO2，100%湿度的培养箱中培3养12h。分别加入含不同药物浓度的培养基10μl，每组设5复孔，同时设立阴性对照（空白试剂）和不加细胞只加培养基的空白对照。HT的8个终浓度为10、20、50、100、200、400、800、1000μg·ml-1,继续培养24h后，MTT法570nm处检测OD值，SPSS13.0软件分析得到药物作用24h的IC50.1.4细胞迁移抑制检测挑选处于对数生长期的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化、离心（800～1000rpm×5min），制成单细胞悬液，然后计数细胞，并调整细胞密度为5.0×104·ml-1。将细胞接种到6孔板中，每孔3ml，细胞接种后置37℃，5%CO2，100%湿度的培养箱中培养24h。待细胞长成单片后，用200ml移液管沿孔的中轴，轻划出一道痕，经PBS轻洗后，用目镜测微尺测量划痕宽度。每组取三个界面，每个界面取三个宽度。每孔加入中药提取物终浓度分别为50、100、200、400、600、800μg·ml-1药物处理，孵育20小时后，用目镜测微尺测量划痕宽度。1.5肿瘤细胞黏附血管内皮细胞检测挑选处于对数生长期的ECV304细胞，经0.25%胰蛋白酶消化、离心（800～1000rpm×5min），制成单细胞悬液，然后计数细胞，并调整细胞密度为5.0×104·ml-1。将细胞接种到6孔板中，每孔3ml，细胞接种后置37℃，5%CO2，100%湿度的培养箱中培养24h。待细胞长成单片后，每空加入100μl，5×104个·ml-1的HeLa细胞，空白组加入100μl培养基，同时加入中药提取物终浓度分别为50、100、200、400、600、800μg·ml-1继续培养5h处理。吸弃上清液，加入PBS洗去未黏附细胞，重复三次。加入无血清培养基180μl，5mg·mL-1MTT20μl孵育4h后，吸弃上清液，加入DMSO150μl震荡10min，570nm处测OD值。黏附细胞数OD值=治疗组OD值-空白组组OD值黏附抑制率=〔1-治疗组黏附细胞数OD值/对照组黏附细胞数OD值〕×100%。41.6CAM血管生成抑制检测将受精鸡卵浸泡于0.01g·L-1新洁尔灭水溶液3分钟，水温40～45℃，拭干后将鸡蛋气室向上，长轴与蛋托呈45°放入37.5℃孵化箱中(保持湿度)。所需鸡蛋数为每组药8枚，每天转蛋不能少于两次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45度为宜。种蛋孵育第7天以75%酒精清洗卵壳，超净台中吹干后用无菌眼科镊在鸡蛋的平钝端小心开出一长约2.0cm的矩形小窗[5]，移去蛋壳和其内面的壳膜，将药物-滤纸薄片小心放置于矩形窗口的边缘1/3处，远离已形成的致密血管网。小心用透明胶纸封闭卵壳口，鸡卵窗口朝上在37℃继续孵育，但不再翻动。72小时后揭去透明胶带，加入1.5ml甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定20分钟。然后以滤纸薄片为中心，剪取3cm的CAM，放入盛有水的平皿中展开，然后平铺于滤纸上，制成CAM标本。CAM血管生成的计数标准：解剖镜下计数载体边缘的血管分支数目。血管生成抑制率/%=（1-给药组血管分支点数/对照组血管生成分支数）×100%2结果2.1ECV304增殖实验结果不同浓度药物对细胞增殖有明显的抑制作用。当浓度为50ug·ml-1以上与对照组有显著性差异。并且随着药物浓度的升高，抑制作用也在增强，成一定时间和剂量依赖性，结果如表1所示。经计算，作用24h的IC50=480.5ug·ml-1，48h的IC50=390.4ug·ml-1。（见表2）。表1不同浓度核桃树皮提取物对ECV304增殖的影响(x±s)组别HT浓度OD值抑制率（％）（ug·ml-1）24h48h24h48h对照组00.641±0.0240.893±0.0670.00.0给药组100.635±0.0380.786±0.0390.811.9200.583±0.031*0.688±0.067*9.022.95500.536±0.039**0.613±0.097**16.231.41000.444±0.069**0.518±0.083**30.741.92000.358±0.036**0.422±0.025**44.052.84000.329±0.015***0.358±0.022**48.759.86000.284±0.020***0.299±0.030**55.666.58000.256±0.016***0.270±0.021**60.069.8与对照组比较，***P0.001,**P0.01,*P0.052.2ECV304迁移实验结果药物在100-800ug·ml-1浓度范围内对ECV304细胞的迁移有显著的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制率也在加大，与对照组有显著性差异。（见表2）.表2不同浓度核桃树皮提取物对ECV304迁移的影响(x±s)组别HT浓度迁移距离(um)迁移抑制率（﹪）（ug·ml-1）对照组0262.43±14.980.0%给药组100218.81±10.28***16.6%200201.05±11.69***23.4%400166.02±14.71***36.7%600127.69±7.61***51.3%80078.81±11.60***65.8%与对照组比较，***P0.001,**P0.01,*P0.052.3肿瘤细胞粘附内皮细胞结果随着药物浓度的加大，黏附到内皮细胞的肿瘤细胞的OD值减少，相应的黏附的细胞数也减少，药物抑制黏附的作用也加大。（见表3）。表3HT对肿瘤细胞粘附内皮细胞的影响(x±s)组别HT浓度粘附细胞OD值粘附抑制率（﹪）（ug·ml-1）对照组00.263±0.082－给药组200.242±0.1048.1%500.237±0.0859.7%1000.193±0.114*26.5%2000.144±0.082*45.2%4000.095±0.056*63.8%6000.086±0.035**67.2%与对照组比较，***P0.001,**P0.01,*P0.052.4鸡胚尿囊膜血管生成实验结果6生理盐水处理组鸡胚尿囊膜血管生成旺盛，分支明显，血管密度大，管径粗；而给药组血管密度稀疏，管径细，分支少（见图1）。低剂量和高剂量给药组血管分支点数分别为63.8±11.2，51.2±10.6，明显低于生理盐水组79.5±15.4。（见表4）表4HT对鸡胚尿囊膜血管生成的影响(x±s)组别HT浓度n血管分支点迁移抑制率（ug·ml-1）（﹪）阴性对照组0879.5±15.4-空白组0880.7±10.6-给药组30ug/ml863.8±11.2*20.960ug/ml851.2±10.6**38.2与对照组比较，***P0.001,**P0.01,*P0.05图1HT对CAM血管生成的影响（A为对照组，B为30ug/ml组，C60ug/ml组）×20倍3讨论内皮细胞的增殖和迁移是肿瘤血管生成最基本过程，也是最重要的过程，本实验利用MTT法和划痕实验检测HT对内皮细胞增殖和迁移的影响，结果发现较低浓度（50ug·ml-1）的HT就能抑制内皮细胞的增殖和迁移，最高的抑制率可以达到69.8﹪和65.8﹪，HT对内皮细胞的增殖和迁移这两方面的作用，在细胞水平上证明了HT可能在抗肿瘤血管生成方面起作用。所以HT在细胞水平是如何发挥抗肿瘤作用的值得进一步深入研究。肿瘤在转移过程中，需要肿瘤细胞脱离组织，通过血液循环移动到其他部位