核桃褐斑病的研究

核桃褐斑病的研究摘要林间观测、室内镜检及人工接种试验证明核桃盘二孢MarssoninajuglandisMagn是核桃褐斑病的病原菌，核桃盘二孢5月初开始产生分生孢子，6月中旬为发病和分生孢子流行高峰期，至7月中旬分生孢子雨后减少，发病减轻。一般以中幼树危害严重，树冠西北侧比东南发病严重，树冠下部比中上部发病严重，内部比树冠表层发病重。多种杀菌剂对核桃盘二孢MarssoninajuglandisMagn的室内毒力测定结果显示，70%甲基托布津、百菌清、多菌灵、退菌特、乙磷铝锰锌对病菌分生孢子的萌发具有强烈的抑制作用；其中甲基托布津、乙磷铝锰锌对病菌菌丝生长的抑制作用明显。关键词核桃褐斑病研究核桃褐斑病以前在我市尚未见报道，是我市城口县近年来爆发的一种病害，该病在陕西、河北、吉林、四川、河南、山东等地均有发生，主要危害叶、嫩梢和果实。引起初期落叶、枯梢，影响树木生长。以前各地报道也多以危害叶片及嫩梢为主，而对危害果实报道较少。2000年以前即由引进的苗木穗条传入我市，最初只发病于少数长势衰弱核桃林、幼林且零星分布，造成的损失也不大，并未引起足够的重视，随着核桃银杏大蚕蛾、核桃长足象等虫灾的大面积啃食危害，造成的机械伤害成为病原菌侵入的最佳途径，同时也成为来年的病原地而反复侵染传播，加上2001年4月我市城口等地遭受严重罕见雪灾，雪灾造成的严重冻伤地加剧了病害的侵染流行，出现了普遍严重爆发的势头，部分危害严重的果树出现早衰死亡的迹象，致使核桃大量提前落果或不挂果，产量大幅下降，并造成部分植株生长衰弱至死亡。2002年-2003年课题组对核桃褐斑病进行了系列观察和研究。1材料和方法1.1林间发病情况观察于2002-2003年在城口高望试验地内进行研究试验，防治示范片设在城口县高观、东安、什邡、修齐、明通、白屏、红花等乡镇。选择不同立地条件具代表性的核桃树10棵，每树固定2枝，每枝固定20片叶，结果时每枝固定10果，分别标记编号作固定样株、样枝、样果。每隔5天调查1次，观测叶片和果实上的病斑出现的始盛期，病斑数量及所占全叶全果面积的百分比。全县核桃主产区按不同海拔、不同坡向等立地条件进行不定期调查，研究点及重点核桃主产区每月调查1次。均在核桃叶、枝、芽、梢、果实、主干等部位进行详细调查病害种类、发病率、感病指数及对地上落果剖查观察落果原因。1.2用病原菌分生孢子捕捉法观察传播扩散规律为研究病原孢子的来源，2002年4月1日至9月，我们用5根平均6米高的竹竿，立于坡度、方位、海拔均不同的6个地点，在竹竿2m、3、4m、5m、6m、7m、8m、9m处的东南西北四个不同方位各放置一块带甘油的载玻片，每隔2天检查一次孢子种类、密度及数量并更换载玻片，记录分生孢子水平传播、垂直传播情况；捕捉病原菌孢子时选择6棵标准株，在核桃树冠内挂置培养皿，内置涂有甘油的玻片用夹子分别挂在标准株树冠中上下层，每层分东南西北四个方向，逐日定时换取玻片镜检，每玻片一次观测九个视野，分别统计分生孢子数以次来分析孢子扩散的时期。1.3核桃褐斑病病原菌的鉴定与分离培养1.3.1室内的实验室鉴定在从各样地内采回的核桃病果、枝叶上，采用徒手切片法切取病健交界处的组织，从5月份开始至8月底每隔5天在室内显微镜40×10倍～10×100倍显微镜下观察；制作病害各个时期的石蜡标本封存。1.3.2制作培养基制作适用于一般真菌培养用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其配方成分如下：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂17克。水1000毫升和用于分离病原真菌的肉汁胨培养基，其配方成分如下：牛肉浸膏3克，蛋白胨5-10克，琼脂17克，水1000毫升。1.3.3病原分离2002年4月下旬从林中按不同海拔、不同标准地采集核桃病害标本，经火焰表面消毒后用90%医用酒精浸泡3秒，再用无菌水冲洗3次，切取核桃叶、果病部与健康部交界的组织，经表面消毒后，置于培养皿PDA培养基上，每只培养皿接4－5块；或将消毒好的病组织块接入试管PDA斜面上，每只试管接1块，均置于生化培养箱中培养（温度控制24－28℃），采用一般分离的方法分离得病原菌的纯种分生孢子悬液，稀释20-100倍后，用倒平板法接入PDA培养基内，置于生化培养箱中培养（温度控制24－28℃），观察病原菌菌落发育进度、菌落形态特征。并保存病原菌菌种待用。1.4病原菌接种试验验证病原菌侵染情况2002年5月课题组采用伤口接种、喷洒接种两种方法进行了接种试验，试验地选择在高望镇金洪3社，试验地条件为一块2-3年生幼林纯林，未见发病，面积约1亩，周围与农田和杉木林，与核桃历史病区相隔2公里。1.4.1伤口接种：以组为单位取核桃嫩枝5根，除留顶部20张叶片外，其余的全部去除（用剪刀剪除可以不伤皮），将核桃褐斑病病原菌，加5毫升灭菌水，配成悬悬浮液，用接种针在火焰上灭菌后，蘸孢子悬浮液在叶上刺孔，对照蘸无菌水刺孔。将对照和接种核桃枝分别保湿24个小时，（放在塑料袋内）扎上口，于3、5、7、9天观察发病情况。1.4.2喷洒接种：以组为单位取核桃嫩枝5根，除留顶部20张叶片外，其余的全部去除（用剪刀剪除可以不伤皮），将核桃褐斑病病原菌，加10毫升灭菌水，配成悬悬浮液，在显微镜下观察应该有20～30孢子，用小型喷雾器喷洒孢子悬液于叶面，叶背，对照喷无菌水（先喷对照）。将对照和接种核桃枝分别保湿24个小时，（放在塑料袋内）扎上口，于3、5、7、9天观察发病情况。1.5室内药物防治试验将70%甲基托布津、百菌清、多菌灵、退菌特、乙磷铝锰锌5种杀菌剂按不同的浓度，用微型喷雾器分别喷于培养基上，在18～20C的情况下，用40%的福尔马林杀死，镜检萌发率。2、结果与分析2.1核桃林受核桃褐斑病危害情况，病情调查结果如下表1核桃褐斑病标准地调查汇总表（城口2001年9月）标准地数调查地点树种组成海拔(m)调查株数(株)感病株数(株)感病株率(%)调查果数(个)感病果数(个)感病果率（%）感病指数(%)1东安沙湾核桃10002525100.00%237523751001002东安漆树核桃1050252392.00%125012501001003高观金江核桃90011100.00%45734575.4970.533高观金江核桃90011100.00%27016059.2654.073高观金江核桃91011100.00%29819665.77483高观金江核桃90011100.00%1207058403高观金江核桃9501616100.00%70617061100100小计高观金江核桃＊201890.00%8206718287.5264.414高观桥坪核桃88011100.00%37026972.768.384高观桥坪核桃90055100.00%3301986053.334高观桥坪核桃88011100.00%36925669.3862.334高观桥坪核桃90077100.00%21982198100100小4高观桥坪核桃＊1010100.00%3267292189.4164.145高观新鸽核桃91055100.00%105010501001006高观桥口核桃90010990.00%20802080100100合计12912498.13%297012761192.9676.66由表1可见：2001年核桃褐斑病的发病情况是十分严重的，共调查129株，发病株率达到98.13%，果实29701个，发病率达92.96%，平均感病指数76.66。2.2、树冠不同方位发病情况表2树冠不同方位发病情况统计表(城口2002-2003年)方位总叶数（片）病叶数（片）发病率%总果数（个）病果数（个）发病率%东1707845.88%703245.71%南1705934.71%703042.86%西1704828.24%704564.29%北1705130.00%704158.57%从表2看出，树冠西北侧比东南发病严重，树冠下部比中上部发病严重，内部比树冠表层发病重。2.3树冠不同部位发病情况表3树冠不同部位发病情况(城口2002-2003年)部位总叶数（片）病叶数（片）发病率%总果数（个）病果数（个）发病率%上部3505214.86%501326.00%中部35011532.86%502652.00%下部35021962.57%503468.00%树冠内部35024570.00%503774.00%树冠外部3509828.00%501734.00%由表3看出，树冠下部比中上部发病严重，内部比树冠表层发病重，单个病果受光照部位发病率远低于背阴面。2.4褐斑病症状特征经过观察，本病害多发生中幼林，危害果实、嫩梢。果实和叶片上的病斑灰褐色，近园形或不规则形，果实上的病斑初期为灰黑色，果实硬核期在黑斑上产生白色小点，即病菌的分生孢子盘和分生孢子，后期为白色块状物覆盖整个黑斑或果实，使果实变为灰白色（故又称果实白星病），收果时果实变黑腐烂。病叶上产生黑色小点，严重发生时叶片枯焦，提早脱落嫩梢上病斑黑褐色，长椭圆形，稍凹陷，其上亦生小点；对幼苗危害从顶梢嫩叶开始，并扩散至整株。2.5病原菌的确定在20株病株上取105个病果病叶，分离组织551片，其中核桃盘二孢菌出现547次，占98.7%，用该病原菌的分生孢子悬液做人工接种试验，发病达95%（表4），对照不发病，经过观察发病过程与自然发病过程相同，经过再分离，分离到原接种菌分别占97%，证明核桃褐斑病是由核桃盘二孢菌寄生所致；通过上述接种试验以及病组织徒手切片镜检后初步鉴定该病原菌为MarssoninajuglandisMagn，属于真菌半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目的核桃盘二孢菌（以前称盘单隔孢，），分生孢子暗褐色，垫状，分生孢子梗无色，短小，分生孢子无色，纺锤形，微弯，双胞，上下孢子不等，上细下大，顶端略弯成短钩状、半月型。分生孢子无色，双孢，上部细胞顶端常弯成短钩状，大小0.2-29.4～4.6-6.2um。其有性世代黑菌纲球壳孢目Gnomonialeptostyla，林间产生很少。2.6发病高峰与病菌孢子扩散从收集到的孢子种类、时间和数量情况来看，城口在3月至4月底由于气温底，仅能捕捉到少量的杂菌，6月初可以见少量核桃盘二孢分生孢子出现，此时发病早的少部分受害核桃果实病斑上出现白色斑点即分生孢子盘，此时开始产生分生孢子；6月底～8月10日为分生孢子流行高峰期，此时为病果产生分生孢子高峰期，至7月中旬后分生孢子为成熟期，易被雨水冲刷而急剧减少，孢子捕捉量也接近低谷。分生孢子的扩散主要靠风力传播其传播，分水平和垂直传播方向扩散，水平传播距离随着大气，而垂直传播则多在林冠内由雨水的冲刷，有顶层向下层传播，故往往在核桃枝叶茂密的中下层发病最重，而在林冠由于收阳光照射，发病很轻。2.7接种试验结果表4核桃褐斑病病原菌接种试验结果(城口2002-2003年)处理接种时间接种方法接种部位接种枝数发病枝数发病率（%）伤口接种2002年5月针刺接种嫩枝201785.00%2002年5月针刺接种果实201995.00%2002年5月针刺接种叶片201995.00%喷洒接种2002年5月喷洒接种嫩枝201470.00%喷洒接种果实201260.00%喷洒接种叶片201575.00%对照2002年5月喷洒清水嫩枝2015.00%喷洒清水果实2015.00%喷洒清水叶片2000.00%从上表看出，分别接种于嫩枝幼果和叶片上的核桃褐斑病发病率在85%以上，而对照发病率在5%以下，观察到的发病症状与林间发病一致；对接种材料进行再分离得到与原接种菌一致的病原菌，由此可以验证MarssoninajuglandisMagn为核桃褐斑病的致病病原菌。2.8侵染循环和发病规律从2002年7月-2003年8月经过分生孢子捕捉、定点定株观察结果显示，核桃褐斑病的病菌在病枝、叶、病残组织越冬，5月上旬开始发病，越冬后的菌丝体5月中下旬就可以产生分生孢子盘及分生孢子，6月下旬到7月底为发病盛期。分生孢子以7月中下旬为最多，此时病斑不再扩散，病害发育缓慢，当年的分生孢子再次侵染后仍可生长发育直至产生分生