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第五节核酸的某些理化性质及核酸研究常用技术一、核酸的紫外吸收（λmax=260nm）二、核酸的变性三、核酸的复性和分子杂交四、核酸的沉降性质•核酸具有酸性；粘度大；由于嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键，能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。•故常用紫外分光光度法测定核酸的含量。一、DNA的紫外吸收十字绣十字绣之家十字绣之家十字绣图案大全十字绣绣法十字绣品牌二、DNA的变性•在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性(denaturation)。•引起DNA变性的因素主要有：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂等。DNA的变性过程加热部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对①增色效应(hyperchromiceffect)：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；②粘度降低③生物学功能丧失或改变。DNA变性后的性质改变DNA的紫外吸收光谱天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123•加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，meltingtemperature,Tm）。DNA的变性温度•Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。核酸的变性、复性和杂交变性（加热）探针杂交（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）变性：在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。复性：在一定条件下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。三、DNA的复性与分子杂交•将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间（退火annealing），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。•将变性DNA经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。•两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交(hybridization)。•核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。•不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序(homologoussequence)。DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子DNA-DNA杂交示意图DNA-RNA杂交示意图•在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针（probe）。•利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。•常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜四、核酸的沉降性质（sedimentationcoefficient）沉降系数：生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围，为方便起见，把作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。离心机结构示意图转头转头腔沉降样品驱动马达真空冷冻第六节核酸酶及人类基因组计划简介•凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶(nuclease)。•凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。•能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶，restrictionenzyme）。DNA限制性酶•DNA限制性酶是在细菌中发现的专一性很高的DNA内切酶，是基因工程最重要的工具酶，目前已经发现数百种，在特定的DNA上标出各种DNA限制性酶的作用点就是DNA限制性酶图谱人类基因组计划概况（HumanGenomeProject，HGP）该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，1999年我国成为HGP的第六个成员国。HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3×109核苷酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已基本完成。HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。HGP取得的成就完成了人类基因组工作草图绘制,揭示了人类基因组若干细节基本上测定了人类基因组上的碱基序列一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻）基因草图绘制成功，测序基本完成促进了生物信息学、蛋白质组学、糖组学的迅猛发展人类基因组草图绘就，中国科学家功不可没HGP面临的挑战基因的隐私权问题基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题基因资源问题基因知识的滥用问题人类将进入生物经济时代基因——操纵生命的工具基因组——潜藏着巨大的经济价值基因技术——21世纪的投资热点谁掌握了人类基因图谱，就等于谁破译了人类的生命密码，获得了操纵生命的工具。与互联网相比，网络只是对人类的信息沟通带来了巨大的革命，而基因领域的革命则能够从根本上改变人类的命运，基因工程所带来的商业机会将会大大超过网络。