根霉曲的制备杨从举104120300

本科学生综合性实验报告学号104120300姓名杨从举学院生命科学学院专业、班级10应用生物教育B班实验课程名称发酵工程学实验教师及职称唐湘华（实验师）开课学期2012至2013学年下学期云南师范大学教务处编印一、实验设计方案实验序号：1、2实验名称：根霉曲的制备及糖化能力的测定实验时间：2013年3月20日、3月27日实验室：学院1231、实验目的:掌握固体发酵的基本操作步骤；了解根霉曲制作工艺和基本原理；了解糖化酶的测定方法；对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算；了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。2、实验原理固体发酵的一般流程保藏菌种原料斜面活化预处理固体三角瓶培养蒸料固体浅盘培养冷却培养通过固体发酵，根霉在麦麸培养基中进行大量繁殖，产生淀粉酶和糖化酶复合酶系；通过淀粉酶的液化和糖化酶的糖化作用将淀粉转化为还原单糖。淀粉是由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直、链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含100-6000个葡萄糖单位，支链淀粉平均含6000个以上的葡萄糖单位，最高可达300万。淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。接接种种3、实验器材、材料1．器材天平、烧杯、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、培养箱水浴锅、离心机、722分光光度计、移液枪等。2．材料麦麸、根霉AS3.866、自来水柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉。4、实验步骤根霉曲的制备：（1）、培养基的配制与灭菌（约60%含水量）麦麸20g＋20ml水/人→放入烧杯拌匀（以组为单位）→分装于三角瓶→包上纱布（至少6层）→包牛皮纸（一层）→包扎→120℃灭菌1h摇动打散瓶内培养基→冷却至约30℃（2）、接种（AS3.866）液体接种，接种量5%→无菌操作进行接种→摇匀→在瓶壁上写上姓名、接种日期（3）、培养接种后的三角瓶倾斜平放→28℃培养24h→扣瓶（本周四）→继续培养约24~48h→出料（烘干、磨碎）→根霉曲酶液的制备：取1克根霉曲溶解到10毫升缓冲液中，混合搅拌10分钟，纱布过滤，取过滤液备用。绘制标准曲线的方法：先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。0.1%葡萄糖标准曲线的制作取7支试管，编号，按照下表进行操作：葡萄糖溶液体积（ml）0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖含量（㎎）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积(ml)15151515151515OD（540nm）糖化酶酶活测定：取酶液按照下表要求操作测定酶活；操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液步骤250℃保温5分钟50℃保温5分钟50℃保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫升加入待测酶液0.2毫升步骤450℃精确保温10min50℃精确保温10min50℃精确保温10min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀步骤10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色OD=（A+B）/2淀粉酶的液化效果试验:取一只试管装入1毫升1%浓度的淀粉底物，50℃预热5分钟，加入酶液1毫升，反应5分钟，取5毫升稀碘液检测淀粉显色情况。5、实验现象、结果0.1%葡萄糖标准曲线的制作y=0.8701x+0.2108R2=0.997600.20.40.60.811.200.20.40.60.81系列1线性(系列1)线性(系列1)原理：3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。糖化酶酶活测定：5人/大组2人/小组3人/小组管号样品管A1样品管B1样品管A2样品管B2吸光度0.5580.5230.1240.167吸光度计算：OD=（A+B）/2第一小组OD=（0.558+0.523）/2=0.5405第二小组OD=（0.124+0.167）/2=0.1455淀粉酶的液化效果试验第一小组的两支试管加入碘液都呈无色。糖化酶的酶活力：是指在PH=6.5，反应温度为50℃的条件下，每分钟降解0.1﹪淀粉产生1㎎葡萄糖所需的酶量。糖化酶酶活力单位（IU）：1*2.0*1010*5*)2108.08701.0(xy=1*2.0*1010*5*)2403.05405.0*1465.1(=9.485注：5为测定OD值前的稀释倍数；分子中的10为根霉曲的稀释倍数；分母中的10为反应时间10min;0.2为所取的酶量；1为本实验所取得根霉曲的量。二、实验总结1、注意事项①培养基的配制过程中一定要摇匀、拌匀，避免部分地区结成团。②在封口过程中一定要按照相关规范进行，避免包扎不严或厚度不够。③充分保证灭菌的时长和效果，以免杂菌干扰。④灭菌时一定要熟练高压蒸汽灭菌锅的操作，不得违规操作。⑤准备接种时，一定要让培养基冷却至30℃以下才能接种，以免杀死菌种。⑥使用超净工作台前进行20~30分钟的紫外杀菌消毒，使用过程中严格遵守相关操作流程。⑦接种完成后，一定要充分摇动打散瓶内培养基，之后才能放入培养箱中培养。⑧28℃培养24h后要进行扣瓶，以使菌种更好的生长和繁殖。酶活测定注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时。2、心得体会教师评语及评分：签名：年月日