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1棉花基本生物技术操作手册华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室棉花课题组二00三年七月·武汉2目录1.MS培养基母液配制………………………………12.棉花胚性愈伤的诱导及植株再生………………23.棉花原生质体操作………………………………34.根癌农杆菌介导的遗传转化……………………65.DNA的提取和检测………………………………86.RNA的提取和检测………………………………107.分子标记……………………………………………8.分子杂交……………………………………………3前言随着本课题组科研队伍的不断壮大，科研工作的全面开展和深入，各个研究方向开始交流渗透，急需一本规范的实验操作手册为课题组各个成员提供指导.手册是由本课题组多个研究方向的成员参照标准的操作程序结合自身的经验编写而成,因此具有一定的科学性和可操作性。这本手册是在张献龙教授的大力倡导和支持下完成的，课题组各个成员都积极参与了手册的编辑，在此一并致谢。金双侠编写了手册第一，二，八部分；孙玉强编写了第三部分；梁绍光编写了第四部分；朱龙付编写了第五部分；涂礼莉编写了第六部分；贺道华编写了第七部分。杨细燕负责部分文字的输入及编辑工作，涂礼莉负责全文的校对和编辑工作。这本手册的编辑是本课题组第一次有益的尝试，经验不足，难免有许多纰漏，期盼课题组在今后的不断发展中能够不断改进和丰富这本手册。4MS培养基母液配制一、大量元素（20倍）母液(g/L)KNO338NH3NO333MgSO4·7H2O(无水MgSO4)7.4(3.8)KH2PO43.4CaCl2·2H2O(无水CaCl2)8.8(6.6)二、微量元素（100倍）母液(g/L)CoCl2·6H2O0.0025CuSO4·5H2O0.0025H3BO30.62KI0.083MnSO4·4H2O2.23NaMO4·2H2O0.025ZnSO4·7H2O0.86三、铁盐（100倍）母液(g/L)FeSO4·7H2O2.78Na2EDTA3.73四、B5有机物VB1(硫胺素)10mg/lVB5（盐酸吡哆醇）1mg/lVB6（烟酸）1mg/l肌醇100mg/l甘氨酸2mg/l五、生长调节剂生长素（2，4-D、IBA、IAA、NAA等）细胞分裂素（KT、ZT等）母液配制注意事项：1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解,逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl2否则容易产生沉淀,定容到一升。2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释5成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3.配制铁盐时,两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生,然后才能使用。4.各种生长激素一般可以用1摩尔/升的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染6.各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中,发现有沉淀后，不得使用。6棉花组织培养一、无菌苗的培养将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下：2/1MS大量元素+葡萄糖15克/l+phytagel2.5g/l，三至四天暗培养，一至二天光照培养。二、愈伤组织的诱导选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，接种于诱导培养基上配方如下：MS无机盐+B5有机物+2,4-D0.1mg/l+KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l三、非胚性愈伤组织的增殖MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+2,4-D0.05mg/l+KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/，或者是MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l(针对那些增殖迅速的愈伤)。四、愈伤组织的分化愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基（MS+B5有机物+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/l+KT0.15mg/l+IBA0.5mg/l）中，进一步分化成胚状体。五、胚性愈伤组织的继代MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半)+B5有机物+IBA0.5mg/l+KT0.15mg/l+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/l+Asn(天冬酰胺)0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l六、成苗生根培养基MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半)+B5有机物+IBA0.5mg/l+NAA0.5mg/l+Gln1.0mg/l+Asn0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l七、胚性愈伤组织的悬浮培养基MS无机盐+B5有机物+Gln(谷胺酰胺)0.2mg/l+Asn(天冬酰胺)0.2mg/l+NaCl1.0g/l+KCl1.0g/l+葡萄糖30g/l7棉花原生质体操作一、材料的准备1.胚性细胞悬浮系的建立：从固体培养基上取继代两周的胚性愈伤组织于MS+谷氨酰胺0.2g/l+天门冬酰胺0.2g/l+葡萄糖30g/l的液体培养基中(每瓶40ml),120转振荡培养,每7天继代一次,4周后可以用于原生质体分离。2.无菌苗的培养：种子去壳消毒播种在1/2MS培养基上,10天后叶片充分伸展开后可分离原生质体。二、原生质体的分离1.悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1g左右的悬浮培养物于15×60mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5-3ml酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封口,置于摇床上40转或静置,28℃黑暗条件下酶解18-22小时。2.叶肉原生质体的分离:把叶片放在15×60mm的培养皿中,并用解剖刀将叶片切成0.1cm宽的细条,后加入1.5ml酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封口,置于摇床上10转或静置,28℃黑暗条件下酶解14-18小时。三、原生质体的纯化1.酶解后的原生质体混合物经40目的不锈钢网去掉渣子,CPW9M洗涤,滤液在10ml的离心管离心10分钟(800rpm),使原生质体沉于管底。2.沉淀物用3mlCPW25S悬浮,在其上加入1ml的CPW9M离心2-6分钟(700rpm),原生质体在两液面形成一条带,其他的杂质及少量的原生质体沉于管底。3.将原生质体轻轻地吸出,转入另一试管,用电融合液离心洗涤5-6分钟(700rpm),去掉上清夜,用电融合液悬浮至2-10×105/ml备用。四、原生质体活性检测FDA溶液(5mg/ml)按25μlFDA/ml原生质体的比例加入FDA,5分钟后,在荧光显微镜下检测原生质体的活性(暗视野下发荧光的原生质体数/明视野下原生质体总数)。五、原生质体融合(电融合)1.将悬浮好的双亲的原生质体等体积混合。2.用吸管取大约1.6ml悬浮液于环形融合小槽(FTC-4),Parafilm封口。3.静置5-10分钟,等大量的原生质体沉淀后,在选择好融合参数下诱导融合,可以在倒置显微镜下观察。4.融合后静置10-20分钟,以便融合的原生质体球形化。85.吸出融合产物后,离心5-6分钟,用培养基悬浮到合适的密度进行培养。六、原生质体培养棉花的原生质体培养常采用KM8P或MSB液体培养,待形成肉眼可见的愈伤组织后,转移到继代培养基,接下来的操作详见遗传转化操作部分。七、再生苗的鉴定1.形态学鉴定:叶形,株高等2.细胞学鉴定:染色体,气孔3.分子标记鉴定:RAPD,AFLP,SSR,CAPS,RFLP,Southernblotting八、相关的酶液,洗液及培养基1.enzymemixtures(仅供参考)100mlmannitol(9%)9gNaH2PO4.2H2O(0.011%)0.011gCaCl2.2H2O(0.36%)0.36gMES(0.12%)0.12gCellulaseR-10(3%)3gPectinase(1.5%)1.5gHemicellulase(0.5%)0.5g2.CPW(mg/l)pH5.8CaCl2.2H2O1480KH2PO427.2KNO3101.0MgSO4.7H2O246.0CuSO4.5H2O0.025KI0.16CPW9M添加90gMannitol；CPW25S添加250gSucrose3.electrofusionmedium(100ml)0.1mMCaCl2.2H2O，10%(w/v)mannitol4.KM8PorganicelementsSugar(g/l)Sucrose0.25Mannose0.25Glucose68.4Fructose0.259Ribose0.25Xylose0.25Rhamnose0.25Cellobiose0.25Sorbitol0.25Vitaminsandorganicacids(mg/l)Inositol100Nicotinicamid1Pyrridox-HCl1Thiamine-HCl10D-Ca-Pantothenate1Folicacid0.4p-Aminobenzoicacid0.02Biotin0.01Cholinchloride1Ascorbicacid2VitaminA0.01VitaminD30.01VitaminB120.02Glycine2Na-pyruvate20Citricacid40Malate40Fumarate40Organicsupplements(mg/l)Caseinhydrolysate25010根癌农杆菌介导棉花愈伤组织遗传转化1．愈伤状态的调整和活化选择再生性较好的棉花品种的胚性愈伤组织接种于增殖培养基上，挑取细颗粒(非粉末)胚性愈伤两周继代一次，在继代过程中尽量使愈伤状态均一生长同步，减少愈伤中幼胚的发生，待增殖到足够的量后继代于预培养培养基上弱光培养(非暗培养)十天即可用于侵染。2．农杆菌的活化和保存2.1准备：农杆菌，MGL液体培养基（含kan50mg/L），无菌三角瓶，LB（固、液）培养基（含kan50mg/L），灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5ml离心管2.2操作：2.2.1活化，悬浮：超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5℃暗培养36-48hr，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5℃暗培养36-48hr，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27℃、200rpm摇2hr，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。2.2.2菌株的保存：从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm、26℃摇48hr，按菌液和甘油1：1加入1.5ml离心管混匀，-70℃保存。注意：从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱；农杆菌在LB平皿内保存时间不宜过长应尽量保持新鲜；用MGL培养基悬浮农杆菌时，某些菌株若出现结块，可在瓶内放入几根灭过菌的大头针，或者结合减少悬浮时间，在其结块前进行侵染。3．浸染，共培养：3.1准备：经活化生长旺盛胚性愈伤，经活化农杆菌，无菌培养皿，无菌滤纸113.2操作：把胚性愈伤从三角瓶转入无菌培养皿，去掉幼胚，发白和死亡等状态不好的愈伤，吹5分钟使表面稍为干燥，把经活化的菌液倒入其中，刚盖过表面为宜，搅匀，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃暗培养38-42小时，待少部分愈伤表面出现不太明显的菌落结束共培养。3.3注意：侵染时愈伤表面稍为干燥可以增加农杆菌的吸附；共培养过程中愈伤上带过多的菌液容易导致愈伤在共培养过程中受缺氧和毒害等不利环境条件而大量死亡，可以通过增加侵染时菌液的浓度和风干代替滤纸吸干等方法来提高愈伤表面的农杆菌密度；共培养时愈伤上的残渣过多容易滋生农杆菌，使其增殖过快而不利于以后的操作。4．选择培养4.1准备：无菌水，无菌滤纸，头孢酶素，无菌培养皿，选择培养基4.2操作：把经过共培养的愈伤连同滤纸一起取出浸入含500mg/LCef的无菌水中，把滤纸上的愈伤洗干净，倒掉洗