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1分子遗传学基础综合性实验报告10农生一班第一组卢**胥**闫**摘要抽取水稻叶片总DNA，利用PCR仪扩增使其总量增加，在利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测DNA的纯度与分子量，同时通过对电泳带型分析判断水稻样品是属于粳稻或籼稻。关键词DNAPCR琼脂糖凝胶电泳引言DNA分子标记技术的研究始于1980年,本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段,DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异,通常也称为DNA的指纹图谱。DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性,对隐性的农艺性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速。DNA分子标记以其显著的优点广泛应用于动植物遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等诸多方面。DNA微量抽取：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠（SDS）等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂。再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白变性。最后加入无水乙醇沉淀DNA；沉淀的DNA，即为植物总DNA，溶于TE溶液中保存备用。多聚酶链式反应：多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。1材料及方法1.1实验材料、器具及试剂水稻幼叶【21号、22号、27号、28号、223号、224号、249号、台中65号、IR64、9311（籼稻）、日本晴（粳稻）】高速台式离心机，振荡器，水浴箱，1.5ml离心管架，玻璃滴管，移液器，研钵，1.5ml离心管，2ml离心管，枪头，烧杯，量筒等。无水乙醇，氯仿，异戊醇，TE缓冲液（pH8.0）,抽提液（200mMTris-HCl,PH7.5;250mMNaCl;25mMEDTA;0.5%SDS）2PCR仪，2ml离心管架，移液枪，1.5ml离心管，0.2ml离心管，dNTP，Taq酶，引物一对（RM1F，RM1R），10×PCR反应缓冲液，灭菌双蒸水。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉。琼脂糖，TBE电泳缓冲液，GoldenView，载样缓冲液1.2实验步骤DNA提取：①取幼叶0.1g左右放于研钵中,加入液氮，将叶片磨成粉状，倒入1.5ml离心管中。②约用400μl抽提液洗涤研钵，也倒入离心管，混匀。置于65℃水浴中30分钟。③加入800ul氯仿，振荡，充分混匀。④12000rpm离心15分钟。取上清液于1.5ml离心管。⑤加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置直到DNA析出。⑥12000rpm离心5分钟，去上清液。加入70%乙醇漂洗。适当风干，溶于100-200μlTE溶液中待用。PCR扩增DNA：①PCR反应混合液的制备（n为样品数）n×0.4μldNTPn×2.0μl10×PCRbuffer（含15mMMgCl2）n×0.2μl引物Fn×0.2μl引物Rn×0.2μlTaq酶n×16μlddH2O混匀②吸取19ul混合液与PCR管中，加入1ulDNA样品，盖好盖子，混匀，立即置于PCR仪上进行扩增。③结束反应，PCR产物放置于4℃冰箱中待电泳。琼脂糖凝胶电泳：①称取0.8g琼脂糖加入盛有100ml1×TBE电泳缓冲液的500ml三角瓶中，摇匀。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，冷却到60℃，加入10μl的GoldenView，并摇匀。②用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。③充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。④用移液器吸取上次实验抽提的水稻总DNA4μl样品于点样板小孔中，再加入5μl1×TBE电泳缓冲液及1μl的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10μlλDNA(HindIII酶切，30ng/ul)作为分子量标准。⑤打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20分钟后即可观察。⑥将凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到白色条带。根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量，并确定是粳稻或籼稻。2实验结果与分析32.1.水稻总DNA带型：分析：从水稻总DNA的带中看出，有部分DNA已经降解，因为当时提取DNA时没有及时进行处理，而是在冰箱中保存，一周后才进行电泳。DNA在溶液中，尤其是水的稀溶液中，会发生自然的降解作用。降解作用速率和温度关系不大，但是反复的冻融会加速DNA的断裂和降解。还有是可能因为在提取DNA是污染了DNA样品，导致DNA加速降解。还有将样品DNA与MarkerDNA作比较，可以发现样品DNA分子量较小2.2.水稻各个样品的带型：4分析：从上图可以看出有不同带型，其中的序号对应的水稻样品如下：123456789101112台中6522393112827249日本晴22421IR6422MarkerDNA已知9311为籼稻品种，日本晴为粳稻品种，则可以粗略判断21号、223号、224号为籼稻品种；28号、27号、249号、22号、台中65为粳稻品种；而IR64的带型介于9311与日本晴之间，无法判定。3讨论通过对水稻的总DNA进行琼脂糖凝胶电泳可知，DNA容易降解，不宜久放，即使是在冰箱里面，故DNA适于当天提取当天进行PCR扩增。在对PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳时，对得到的带进行分析，可以得到如下结果：21号、223号、224号为籼稻品种；28号、27号、249号、22号、台中65为粳稻品种；而IR64的带型介于9311与日本晴之间，无法判定。参考文献【1】普通遗传学综合性实验/刘向东,李亚娟主编.中国农业出版社，2011.7，第四章【2】遗传学综合实验/主编李雅轩,赵昕，北京:科学出版社,2006