植物DNA的提取

植物DNA的提取及凝胶电泳分析学生：潘园园指导老师：王慧中应奇才实验目的了解真核生物基因组DNA提取的原理。掌握CTAB法提取植物基因组DNA及琼脂糖凝胶电泳的方法。1、植物DNA提取非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可以溶解细胞膜，并能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/LNaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白以及多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，使之形成纤维状絮团，CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去，离心沉淀收集得到DNA。实验原理实验原理2、凝胶电泳分析琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶是分离和纯化DNA片段的标准方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离小分子的核酸；琼脂糖凝胶孔径较大，应用于大分子核酸的分离和纯化，分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（ethidiumbromide,EB）染色，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。实验原理在紫外光下至少可以检测出1~10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。实验材料和试剂实验材料新鲜烟草叶片实验试剂2×CTAB缓冲液氯仿/异戊醇（24：1）液氮70%乙醇异丙醇TAE缓冲液6×DNA凝胶上样缓冲液琼脂糖溴化乙锭（EB）标准分子量DNA实验步骤CTAB法提取植物总DNA1、取2cm新鲜烟草叶片于研钵中，加入液氮研磨，研磨成碎粉状。2、迅速转移到1.5ml离心管中,加入了600μl2×CTAB提取液（65℃预热），缓慢振荡30s。放入65℃振荡水浴锅中40~60min。3、加入等体积氯仿/异戊醇，缓慢颠倒混匀至无明显分层，室温静止1~2min。室温下10000r/min离心10min。4、取500μl上清液，加入2/3体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，絮状沉淀为DNA，-20℃放置1h。5、12000r/min离心10min，去上清，加入200μl70%乙醇洗涤。6、12000r/min离心5min，去乙醇，风干。7、用30μlTE或者双蒸水溶解DNA，取5μl电泳，剩余-20℃保存备用。实验步骤琼脂糖凝胶电泳1、稀释缓冲液的制备用50×TAE配置成1×TAE稀释缓冲液，待用。2、胶液的制备称取1g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入100ml1×TAE，即1%琼脂糖凝胶。放入微波炉（或电炉）上加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。3、胶板的制备向冷却至40～50℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB）溶液，使其终浓度为0.5μg/ml，将凝胶倒入胶槽里，注意不要有气泡。实验步骤4、加样取5μl提取的植物DNA溶液与1μl溴粉蓝液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。5、电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。保持电压在80～110V，电流在40mA以上。6.、观察和拍照在波长为254nm的长波长紫外灯下电泳胶，并拍照保存。注意事项1、液氮研磨时，应当快速转移，降低DNA的降解。2、CTAB裂解液要预热，以抑制Dnase，加速蛋白变性，促进DNA溶解。3、各操作步骤要轻柔，尽量减少机械外力造成DNA降解。4、取上清时，不应贪多，以防非核酸类成分干扰。5、异丙醇要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等得分相及DNA沉淀。6、溴化乙锭EB是强诱变剂，具有高致癌性，要求在整个操作过程中必须带一次性手套。实验结果注：14种植物基因组DNA电泳图(M:1kbmark,1-14不同品种DNA)谢谢！