植物中SOD的分离提取及性质研究实验报告

1/16植物中SOD的分离提取及性质研究--------------------综合实验报告学校：学院：班级：同组成员：一、实验目的SOD广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射，抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病，自身免疫性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品2/16中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并且确定SOD同工酶的类型。根据SOD的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法判断同工酶的最适温度，最适PH，以及双氧水对酶的活力抑制。并采用改进的自氧化法测酶的活力.二、实验原理1、邻苯三酚自氧化法根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specificactivity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（mg∕mL）;每ml样品中的酶活性单位数（U∕mL）。酶的纯度越高酶的活性也就越高。SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增3/16加2、不连续电泳不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技术。三、实验试剂大蒜、氯仿-乙醇混合液、维生素、冷丙酮、邻苯三酚、浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺。）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/LPH7.8磷酸钠、10mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷;氨基丁三醇）、甘氨酸1．2.45mol/LNBT溶液：称取200mgNBT溶于蒸馏水中并定容至100ml置棕色试剂瓶中，避光贮存。2.3.60mol/LPH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/LTEMED和2.8维生素）：在100ml3.60mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液中加0.42mlTEMED及1.32mg维生素，置棕色瓶中贮存。3．PH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，4/16加水至1000ml,用是加水稀释10倍。4.PH8.91.5mol/LTris-HCl缓冲液：称取18.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris）加24ml1mol/L盐酸，加水至100ml.5.PH6.80.5mol/LTris-HCl缓冲液:称取Tris6.0g,加48ml1.0mol/L盐酸溶液100ml。6.以及不同浓度的磷酸缓冲液。0.05mol/L，PH如下5.86.57.07.37.67.87.98.37.凝胶贮液以及凝胶A液：48ml1mol/LHcl,36gTris,0.24mlTEMED.B液：48ml1mol/LHcl,5.9gTris,0.46mlTEMED。C液：30gAcr,0.8gBisD液：10gAcr,2.5gBisE液：4mg核黄素F液：40g蔗糖（以上各液定容至100ml）凝胶（体积比）：A:C:E:水=1:3:1:3浓缩液（体积比）：B:D:E:F=1:3:1:3四、实验仪器离心机离心管水浴锅电热炉研钵移液枪移液管胶头滴管试管若干721型分光光度计以及紫外分光光度计DYCZ-240D型垂直板电泳槽锥形瓶冰箱不同型号容量瓶若干托盘天平5/16烧杯玻璃棒五．实验内容①制备酶液：SOD的提取：称取20~25g大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使组织细胞破碎。再加入2~3倍体积的0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨，搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后以5000r/min离心15min，弃去沉淀，得提取液。（留取1ml提取液备用，正确量取剩余上清液体积，记录）除杂蛋白向提取液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液，搅拌15min,5000r/min，离心15min,弃除杂蛋白，得粗酶液。（留取1ml粗酶液备用，正确量取剩余粗酶液的体积，记录）SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000r/min,离心15min得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液中，于55~60°C热处理15min，再离心弃沉淀的得SOD酶液（留取1ml酶液备用，正确量取剩余酶液的体积，记录）②SOD性质的测定：1.粗酶液活性测定（邻苯三酚法）6/16试剂ml空白管对照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2吸光值加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓Hcl停止反应，在420nm下测定吸光值。2.酶液的最适温度探究试管试剂ml1号2号3号4号5号温度处理（）0255075100PH8.3磷酸缓冲液33333SOD酶液0.10.10.10.10.1蒸馏水22222在各自的温度下静置10min,然后取出邻苯三酚0.20.20.20.20.2吸光值加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓Hcl停止反应，在420nm[6]下测定吸光值。3.酶液的最适PH探究试管试剂ml123456SOD酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸缓冲液（PH）5.86.57.07.37.67.9蒸馏水222222在最适温度下，水浴10min,取出7/16邻苯三酚0.20.20.20.20.20.2吸光值4．抑制剂对酶液活性的影响（1）对SOD活力抑制试管试剂ml12341.5％H2O215μl20μl25uL30ulSOD酶液0.10.10.10.1于30℃水浴恒温30min，取出迅速冷却至25℃邻苯三酚0.20.20.20.2吸光值③同工酶类型的判断：（不连续电泳）1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的锥形瓶.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,防止夹坏玻璃板.3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.水封的目的是为了使分离胶上延平直,并隔绝空气，凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.8/165.在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳.要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.6.加样，取10ul样品溶液,再加入10ul2倍样品缓冲液,上样量分别为5ul和3ul.7.按下表用微量注射器距槽底三分之一处加样,加样前,样品在沸水中加热3分钟,去掉亚稳态聚合.（注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.）槽口12345试剂SOD酶液和SOD酶液SOD酶液和SOD酶液SOD酶液123458.电泳槽中加入缓冲液,接通电源,进行电泳,开始电流恒定在10mA,当进入分离胶后改为20mA,溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时,停止电泳.9.SOD活性染色取凝胶板，按下列顺序浸泡于培养皿中染色①2.45mol/LNBT溶液中，再黑暗条件下浸泡20min，NBT溶液应置于暗处，4贮存以免氧化变质，染色时也至于暗处，如凝胶板厚可延长浸泡时间②置于3.60mol/LPH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/LTEMED和2.8维生素）中，在黑暗条件下浸泡15min9/16③将凝胶板移入5.0mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液中浸泡，在4W日光灯下照20-30min,光照应均匀，使无SOD区的NBT充分还原成蓝紫色的甲月替。经上述染色和光照后的凝胶板，在蓝色背景上出现清晰透明的SOD活性染色。染色后的凝胶板用水漂洗数次后，再用保存液浸泡。④酶活力测定：⑴邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中加入缓冲液4.5ml,于25保温20min,然后加入预热的邻苯三酚10（对照管用10mmol/LHCl代替），迅速摇匀倒入1cm光径的比色皿，在325nm下，每隔30s测吸光度一次，可适当调整邻苯三酚加入量，将自氧化速率控制在0.070A/min.⑵SOD或粗酶液的活性测定:在试管中加入约10酶夜，其它操作同自氧化速率的测定，按下列公式计算酶活力：单位体积活力（U/ml）=反应液总体积总活力单位数（U）=每毫升酶夜活力单位数酶夜的总体积六、要求运用的实验技术高速离心技术、有机溶剂沉淀技术、分光光度技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术等。七、实验结果与讨论10/16实验结果记录：1.粗酶液活性测定（邻苯三酚法）试剂ml空白管对照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2平均吸光值00.2630.2500.2450.217粗酶液00.050.10.150.20.250.3空白管对照管提取液粗酶液酶液吸光值实验结果分析：依照邻苯三酚法测定酶活力一号管作为空白管，在实验中起对照作用。二号管作为对照管，加入了邻苯三酚。三、四、五号试管吸光度依次下降且均低于对照管，表示酶活力依次增强。且酶液活力远高于粗酶液。11/162.酶液的最适温度探究试管试剂ml1号2号3号4号5号温度处理（）0255075100PH8.3磷酸缓冲液33333SOD酶液0.10.10.10.10.1蒸馏水22222在各自的温度下静置10min,然后取出邻苯三酚0.20.20.20.20.2平均吸光值0.2000.4950.3490.2280.850酶液的最适温度探究00.10.20.30.40.50.60.70.80.91号2号3号4号5号试管平均吸光值平均吸光值实验结果分析：实验中采取单一变量的方法，严格控制五支试管中除温度单一变量不同外其实实验变量完全相同，可以有效的验证sod酶的最适温度。其中取的五个温度梯度，分别为0℃，25℃，50℃，75℃，12/16100℃，其中0℃的吸光光度值为最低，经验证为实验错误。从25℃到75℃，随着温度的升高，吸光光度值依次降低，证明在一定范围内，随着温度的升高，酶活性升高。在75℃达到活性最高点（研究范围内）而从75℃和100℃的数据中可以看出，吸光光度值升高，说明了此时sod酶已经失活，无法催化。在此范围内，得出酶的最适温度为75℃。3.酶液的最适PH探究试管试剂ml123456SOD酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸缓冲液（PH）5.86.57.07.37.67.9蒸馏水222222在最适温度下，水浴10min,取出邻苯三酚0.20.20.20.20.20.2平均吸光值0.3610.2510.1460.1050.0650.15013/16酶液的最适PH探究00.050.10.150.20.2