植物分子系统学研究进展

植物分子系统学研究进展推动分子系统学发展的主要因素是：1.分子生物学方法的不断改进；2.基因组的全序列测定；3.用于分子系统学研究的基因种类不断增加，对这些基因进化规律的认识不断深入；4.化石DNA的研究等，本文将对这些因素作简要的介绍。1.分子系统学实验方法的改进1.1DNA的制备核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。Southern印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Slebos,etal,1990；Smit,etal,1988）、蛋白酶消化法（Impraimetal.1987；Brice,etal.1989）。固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。Barmwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel's运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量得明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。1.2PCR在RFLP及序列分析中的应用。PCR技术自1985年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力.近些年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途。聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温(约93℃-95℃)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温(约50℃-70℃)下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70℃-75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n倍,一般PCR经30-40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR—RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR—RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。2．基因组的全序列测定目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。因为植物对于人类的衣食住行有着很大的关系，因此对植物分子生物学的研究往往集中于一些重要粮食作物如水稻、小麦等及经济作物如油莱、大豆等。有人曾对基因库（GenBank）中有关植物的数据作了统计，其中有90％的DNA序列来自22种植物，而另外10％则来自于30种植物，这些研究一般都是针对某种植物的某个基因作的详细研究。植物的叶绿体基因组相对较保守，很多植物基因已被用于分子系统学研究中，在此简单介绍叶绿体基因组的测序进展。叶绿体是绿色植物进行光合作用的重要细胞器。早在1909年，就有人根据高等植物叶片的花斑性状的非孟德尔遗传现象,推测叶绿体内存在着遗传物质。然而,直到1962年，人们才利用电镜技术首次证实了叶绿体DNA（cpDNA）分子的存在。十年后，才分离到cpDNA。已知的叶绿体基因组大小约为120-160kb，尽少数绿藻的cpDNA的大小超出这个范围。到目前为止，已有6种高等植物的叶绿体基因组完成了全序列测定，这6种植物的cpDNA的差异见下表。叶绿体基因组编码了它自身使用的全部rRNA和tRNA，但是仅编码了叶绿体上几百种蛋白和多肽的一小部分叶绿体上绝大多数蛋白复合体是由核基因组和叶绿体基因组共同编码的。我们可以把cpDNA上的基因分成以下四类：由中国科学家领衔的白菜、甘蓝和油菜全基因组测序项目取得阶段性重大成果,获得了白菜全基因组的精细图,甘蓝和油菜全基因组的框架图。研究表明，白菜、甘蓝和油菜的基因组大小分别约为5亿、6.5亿和11亿个碱基对,白菜和甘蓝含有的基因总数目分别约4.2万和4.5万个,油菜基因覆盖度85%以上。该项成果是国际上首次对三个近缘作物物种进行的整体测序,并且油菜是迄今首个全基因组测序的异源四倍体植物,这不仅对研究作物进化和遗传改良有着重大意义,也对其他多倍体物种的全基因组测序具有重要的参考价值。3．用于分子系统学的主要基因种类及其进化规律3．1叶绿体基因组叶绿体是植物细胞中重要的细胞器,具有自身独立的遗传体系,它编码的物质参与光合作用、氨基酸、核苷酸、脂肪酸等生物合成过程。叶绿体DNA(cpDNA)具有分子量小、结构简单和有独立的进化路线等优点,加之叶绿体基因相当保守,因而对cpDNA的重要基因进行分析,可从进化和系统发育上,揭示物种亲缘关系和阐述生物遗传多样性,并已有大量关于利用细胞器DNA或基因(rbcl,ndhFmatk等基因)来进行遗传与进化的研究和报道。小麦叶绿体基因组中infA-rpl36区域的序列设计引物,对多个小麦族植物,包括在栽培小麦远缘杂交与染色体工程育种中广泛选用的黑麦、簇毛麦和偃麦草属等物种的DNA进行了扩增、测序和系统分析,以期为小麦族中重要物种的遗传多样性与小麦育种提供指导。利用小麦叶绿体基因组中infA-rpl36区域的序列设计引物,对小麦(Triticeae)的12个二倍体和多倍体的物种进行了PCR扩增和序列测定,获得了长度584～603bp的12条DNA序列。序列分析表明,供试物种在infA-rpl36基因间隔区的核苷酸变异明显高于基因编码区。基因编码区核苷酸序列同源性高达97%,表明了目标片段具有高度的保守性。但在5个物种的infA编码区出现了较大的插入、缺失突变,导致推导的氨基酸序列也发生了很大的变化,证实了infA基因是叶绿体基因组中最活跃的基因之一,而rpl36基因的变异较小,说明不同叶绿体基因的进化速度是不同的。基于测定序列建立的种系树分析发现,多倍体物种中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)具有多种不同的细胞质起源,与核基因组一样在进化上较为复杂。3.2线粒体基因组在植物的系统与进化研究中，相对于叶绿体和核基因片段来说，线粒体基因片段由于其分辨率较低、结构复杂而较少应用到系统学研究中。在植物系统发育重建中，来自叶绿体基因组的DNA片段和来自核基因编码核糖体的DNA,片段（nuclearribosomalDNA）是两个最主要的分子证据来源（Olmstead＆Palmer,1994,Solits＆Solits，1998；Alvarez＆Wendel,2003）,近年来,单拷贝或低拷贝的核基因片段被越来越多地用于不同等级的系统发育重建研究中，为系统发育重建研究提供了更为重要的信息来源（Cleggetal.,1997;Geetal.,1999;Sang,2002）。相比之下，利用来自植物线粒体基因组的DNA片段进行系统发育研究仍十分有限，一方面是因为植物线粒体基因组的进化速率比叶绿体基因组更慢从而提供的进化信息有限(Wolfeetal.,1987),另一方面由于植物线粒体基因组在大小和结构上十分不稳定（高频率重排、重复或缺失以及外源DNA的转入等），这些都制约了其在植物系统发育研究中的广泛应用(Palmer,1992;Adams＆Palmer，2003)。。但最新的研究表明，植物线粒体基因组中有些片段是相对比较稳定的，如与呼吸代谢有关的基因（包括cob、cox1、nad1、nad4和nad5）(Adams＆Palmer,2003)，而且植物线粒体中许多基因存在进化较快的内含子，加上被子植物线粒体是母系遗传，因此某些线粒体DNA片段信息同样提供了重要的进化信息（Demesureetal.,1995）,在植物系统发育重建、居群生物学和生物地理学研究中有许多成功的报道（Qiu＆Palmer,1999;Mittonetal.,2000;Gugerlietal.,2001;Sanjuretal.,2002）。如nad1基因编码线粒体呼吸传递链的复合体I———泛醌氧化还原酶（NADH：ubiquinoneoxidoreductase;也可称NADH脱氢酶）的nad1亚基，是一个结构较为稳定的线粒体基因，在迄今已研究过的物种中由5个外显子构成（nad1/A-E）(Gutierresetal.,1999)。4化石DNA的研究以色列魏兹曼研究院的科学家在骨骼化石中发现了保存完好的远古时代的DNA。这一成果发表在近期出版的美国《国家科学院学报》上。化石DNA是保存人类和动物进化、种群动态、迁徙及食物和疾病信息的潜在资源，但如果得不到很好的保存或被现代DNA污染，将很难破译。