植物基因组DNA提取试剂盒的制备与优化

哈尔滨学院本科毕业论文（设计）题目：植物基因组DNA提取试剂盒的制备与优化院（系）理学院专业生物科学年级09—1班姓名赵建丰学号09051126指导教师郑茂波职称副教授2013年6月13日承诺书本人赵建丰，哈尔滨学院理学院，生物科学专业09—1班学生，学号：09051126。本人郑重承诺：本人撰写的毕业论文：《植物基因组DNA提取试剂盒的植制备与优化》，是个人的研究成果，数据来源真实可靠，无剽窃行为。承诺人赵建丰2013年6月13日毕业论文（设计）评语及成绩论文类型：理工类评语：指导教师（签字）年月日评语及评分成绩：答辩委员会主席（签字）年月日院（系）学位评定委员会意见：签字：年月日学校学位评定委员会意见：签字：年月日I目录摘要...................................................................................................................................2ABSTRACT...........................................................................................................................3第一章前言.....................................................................................................................41.1DNA提取的基本原理与意义.........................................41.2DNA提取方法.....................................................51.3硅胶膜对DNA选择性吸收的原理与影响因素..........................51.4试剂盒的发展情况及优势.........................................101.5本文的目的与意义................................................10第二章材料与方法.........................................................................................................112.1材料............................................................112.1.1植物材料...................................................112.1.2试剂与耗材.................................................112.1.3设备与仪器.................................................112.2方法............................................................122.2.1试剂盒的组成...............................................122.2.2试剂盒组成溶液的配制.......................................122.3提取步骤........................................................142.4检测方法........................................................15第三章结果与分析.........................................................................................................16结论...................................................................................................................................17参考文献.............................................................................................................................18致谢.................................................................................................................................19哈尔滨学院本科毕业论文(设计)2摘要DNA是最重要的遗传物质，因此,DNA的提取方法和技术是生物化学及分子生物学最基本的技术,也是生物工程最常用的技术。提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。本文根据植物基因组DNA提取原理，设计了离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒，经过大豆、小麦、棉花和水稻等不同植物材料基因组DNA提取结果的完整性和纯度的检测，证明该试剂盒合适多种植物基因组DNA的提取，并且有较好的效果，能在实验室中推广。关键词：植物DNA提取；提取方法；试剂盒；DNA纯度哈尔滨学院本科毕业论文(设计)3ABSTRACTDNAisthemostimportantgeneticmaterial,therefore,DNAextractionmethodandtechnologyofBiochemistryandmolecularbiologyofthemostbasic,isalsothemostcommonlyusedtechnologyofbiologicalengineering.PurityandstructuralintegrityoftheextractedDNAwasstudiedintheconditionsnecessaryforthegeneengineering.AccordingtothegenomicDNAextractionprinciple,designofcentrifugalcolumntypeplantgenomicDNAextractionkit,integrityandpuritydetectionresultsaftersoybean,wheat,extractionofcottonandriceindifferentplantmaterialsforgenomicDNAextractionkit,provetheappropriateplantgenomeDNAvariety,andhasgoodeffect,canbeextendedinthelaboratory.Keywords:PlantDNAextraction;extractionmethod;kit;DNApurity哈尔滨学院本科毕业论文(设计)4第一章前言DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象。自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展，DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用，DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，因此，提取的DNA得纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必须的条件。而DNA提取试剂盒的出现，满足了快速、方便和大通量的提取需求。1.1DNA提取的基本原理与意义简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境(如Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是基因组DNA抽提的主流。最常用的纯化方法，一是PC抽提+醇沉淀，二是介质法。第一种方法是利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR。其它杂质–如多糖、多酚等-的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。哈尔滨学院本科毕业论文(设计)51.2DNA提取方法DNA提取的方法分为介质法和非介质法，介质法包括试离心柱式提取法，磁珠法。非介质法包括SDS（十二烷基磺酸钠）法，CTAB铵（十六烷基三乙基溴化）法。SDS（十二烷基磺酸钠）法：SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB铵（十六烷基三乙基溴化）法：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。离心柱式提取法：采用特殊硅基质材料制作的可特异结合DNA的离心吸附柱，根据一定的高盐缓冲系统可高效、专一地吸附DNA、RNA的原理（在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA）。去除植物细胞中的蛋白质、糖类等有机化合物采用漂洗液溶解、离心的方式，最后在低盐、高pH值下，用洗脱缓冲液将吸附在硅基质膜上的DNA洗脱下来，从而收集纯化DNA。磁珠法：依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。1.3硅胶膜对DNA选择性吸收的原理与影响因素在水溶液中,DNA分子呈酸性，带负电；silica表面的硅-氧键水化形成硅烷醇基团(silanolgroup)也呈弱酸性，带负电，所以两者之间会产生静电排斥，不能相互结合。除非溶液中同时存在一定浓度的阳离子，后者可以通过形成阳离子桥（cationbridge）而中和DNA和silica表面的负电荷(即静电屏蔽)并使二者结合。大量实验数据也证明，DNA与silica结合的确需要一定浓度的阳离子（包括Na+，K+,NH4+或Mg2+等），所需最低浓度与溶液的pH和silica的种类密切相关，但一般在0.1-1M之间。在同样条件下，常见单价阳离子促进DNA-silica结合的能力从强到弱的次序为K+，Na，NH4。阳离子桥介导的DNA-silica结合可用下图表示：哈尔滨学院本科毕