植物总DNA的提取

1核酸的分离、提取、鉴定与扩增一．植物总DNA的提取[实验目的]核酸的分离纯化是核酸制备及分析的前提和基础，通过本实验将学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法，通过电泳等实验技术研究核酸的性质，同时掌握用PCR技术分析不同材料之间亲缘关系的方法。[实验原理]由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验采用CTAB法提取竹子、香樟的DNA。植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。[实验器材]1、冰箱2、恒温水浴锅3、高速离心机4、陶瓷研钵和杵子5、离心管6、植物材料7、微量加样器[实验试剂]1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）3．乙二胺四乙酸（EDTA）4.氯化钠5．2-巯基乙醇6.无水乙醇7.氯仿8.异戊醇[实验步骤]1、分别称取2g新鲜的竹子、香樟叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），保温30Min，每5min轻轻震荡几次。5.冷却2min后，加入等体积氯仿振荡2~3min，使两者混合均匀；4、10000rpm离心10min，移液器轻轻地吸取上清液至另一新的灭菌离心管中；25、加入2/3倍体积的异丙醇，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合室温放置15min至能见到DNA絮状物；6、10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出7、加入800μl75--80%的乙醇（均可以），洗涤DNA；8、10000rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；9、加入50μl双蒸水，使DNA溶解。10、提取的DNA样品跑电泳，电泳图如下[实验结果]样孔②为竹子，样孔③为香樟由图看出DNA提取浓度不太高，可能是液氮研磨时放置太久所致[注意事项]1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。[思考题]1、CTAB、的作用是什么？答：CTAB可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。2、液氮研磨的原理是什么？答：液氮变为气体时要吸收大量的热，使叶片瞬间冷冻。这样研磨起来就更彻底，更重要的是这种冷冻的方法不会破坏叶片细胞内所含的物质的形态。二、PCR基因扩增PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明的聚合酶链反应。这一技术具有划时代意义的。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。3[实验目的]学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。[实验原理]多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1、变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。[实验器材]1、PCR热循环仪2、tip头、冰盒3、PCR管4、超纯水5、DNA相对分子质量标准物6、移液枪[实验试剂]1、10×缓冲液500mmol/lKCl100mmol/lTris·HCl(pH8.3,室温)15mmol/lMgCl20.1%明胶2、4×dNTP1mmol/ldATP1mmol/ldCTP1mmol/ldGTP1mmol/ldTTP3、Taq酶5U/μL4、DNA模板1ng/μL5、引物1、引物2引物溶液浓度10pmol/μl[实验步骤]1、在PCR管内配制20μL反应体系：反应物体积/μL10×buffer2.0dNTP1.04引物11.0引物21.0Taq酶0.5Template1ddH2O13.5总体积202、按下列程序进行扩增：①、95℃预变性5min②、95℃变性1min③、55℃退火1min④、72℃延伸1min⑤、重复步骤②~④30次；⑥、72℃延伸10min[注意事项]1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。2、取样时注意不要污染药品。[思考题]1、什么是引物二聚体？出现引物二聚体的原因是什么？答：引物二聚体是引物的3'端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。引物二聚体的形成不在于酶，在于引物的设计。引物设计的不合理，造成上下游引物之间形成互配的可能，或者引物自身两端碱基也可以互补的话，就很容易形成二聚体。2、PCR仪的热盖设置有什么优点？答：加有热盖保证了PCR无矿物油操作，避免了人为原因造成的污染三、琼脂糖凝胶电泳检测DNA琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖-3,6-L半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0-9.0的缓冲液中稳定。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。[实验目的]学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。[实验原理]DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相5对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（opencircularDNA,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linearDNA,简称LDNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。[实验器材]1、琼脂糖凝胶电泳系统2、凝胶成像系统3、DNAmarker1、检测样品2、琼脂糖[实验试剂]1、5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml5×TBE：Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）2、凝胶加样缓冲液（6×）溴酚蓝0.25%蔗糖40%3、溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/ml[实验步骤]（一）制备琼脂糖凝胶1、按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~42.00.1~32、称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（二）胶板的制备1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2、有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4、待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。5、加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。6（三）加样用移液枪将将上样缓冲液与DNA样品按1:5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。（四）电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。3、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中，染色30min。4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。[实验结果]PCR没有扩增出产物[实验分析]造成实验失败的可能原因有：①PCR时在管壁贴了标签，致使离心管受热不均，实验失败；②PCR加样时操作不娴熟，酶、模板或其他反应物没有加进去：③酶失活导致实验失败[注意事项]因为EB是强致癌物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。