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三、感受态细胞的制备及转化热激感受态细胞的制备实验试剂CCMB80：KAc10ml(use1Mstock,pH9)，CaCl2*2H2O11.8g，甘油100ml，定容至1L用时每98mlCCMB80加入1mlMnCl2*4H2O(2M)和1mlMgCl2*6H2O(1M)HCl调节pH6.4实验步骤1）划平板活化菌种（DH5α），挑单菌落37°C摇小管过夜，转大瓶,待OD600=0.6～0.7将装菌的大瓶置于冰上15分钟。2）750-1000g(2000-3000rpm)离心12-15分钟，弃上清。必要时可用吸滤器吸干。3）加入离心下来细菌体积的1/3的CCMB80，轻柔的将菌摇散。置于冰上20分钟。4）重复步骤2。5）用原来大瓶菌液体积的1/12.5CCMB80,轻柔的将菌摇散。置于冰上15分钟。6）分装，每管100μl，管子需-70预冷。7）速冻，-70°C存放。电击感受态细胞的制备方法一、实验试剂重蒸水，10%甘油，20%甘油实验步骤1）同热击感受态步骤1，用X-L1Blue菌种。2）5000rpm离心,20分钟，小心倒去上清，加入少量重蒸水,轻柔的将菌摇散。将离心管加满水，混匀，离心(5000rpm)。3）同步骤2，洗2次。4）同步骤2用10%甘油洗一次。5）弃上清后，用与细菌体积相同的20%甘油将细菌均匀分散，分装到预冷的500ul离心管中，每管50μl。6）速冻，-70度存放。方法二、（以50ml菌为例）试剂1MCaCl2（14.7gCaCl2溶于100mlH2O），分装成1.2ml/管。使用时稀释成0.1MCaCl2（1.2ml稀释成12ml）步骤：（50ml菌）1．划平板活化菌种，挑单菌落37℃摇小管2ml过夜，1：100放大（0.5ml菌→50ml菌），待OD600=0.3-0.4，将装菌的瓶子置于冰上10-30min。同时冰上预冷0.1MCaCl2，冷冻离心机4℃预冷。2．3000rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。3．用10mlCaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。置于冰上30分钟。4．2500rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。5．用2mlCaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。每管200μl，管子需预冷6．置于冰上2hr-48hr内使用热击冰上30min，42℃90sec，并上10min。加入200μlLB37℃复苏2hr。农杆菌感受态细胞的制备（电击）1）接种小养（eg.3ML）28℃培养过夜。2）1:100放大培养（eg。300MLYEB中）至OD=0.5。3）icechilled5000rpm10min(冷冻离心机,预冷到4℃)。4）Washedby1mMHEPES(PH7.0)3次(每次10ML)。5）10%甘油洗一次。6）溶于3ML10%甘油中,40ｕL每管于-70℃保存。备注:离心管,dorf管,HEPES,甘油均须冰上预冷,所有的操作以在冰上进行为好.另：农杆菌电击感受态细胞还可按大肠杆菌电击感受态细胞同样的制作。农杆菌电击转化实验1)调节电击仪,使其电脉冲为25ｕF,电压为2.5KV,电阻为400Ω。2)从-70℃冰箱中取出电击感受态细胞（EHA105）,置于冰上使其融化。3)加1ｕL质粒于感受态细胞中，轻轻混匀。4)将上述菌液和DNA悬液加进电击杯的底部，迅速将电击杯放进电击仪。5)按设定的参数,启动对细胞的电脉冲。6)电击以后，尽快取出样品，加入1ML无抗YEB培养基。7)将上述菌液转入1.5MLdorf管中，28℃2小时以上。8)将菌液涂布在加有相应抗生素的YEB培养基上，28℃培养2-3天，直至菌落长出。备注:所有操作最好在冰上进行；电击杯电击之前在冰上预冷；电击杯中要除去气泡。农杆菌感受态细胞的制备（热击）1)从YEB和YEP培养基平板上分别挑取单菌落，接种于含有3ml液体培养基的试管中，28℃振荡培养16~18h。2)从试管中取出200μl菌液接种于含20ml相应液体培养基中（100倍稀释），培养4~6h至对数生长期。取1.5ml菌液加入到1.5ml的无菌离心管中，4℃，3000rpm离心5min，弃上清。沉淀用800μl的预冷TE溶液（10mMTris-HClpH7.5；1mMEDTApH7.5）洗一次，4℃，3000rpm离心5min，弃上清。3)沉淀用800μl的YEB（YEP）培养基重新悬浮，然后按每管200μl分装到1.5ml的无菌离心管中，液氮速冻后于-70℃保存备用。农杆菌热击转化实验1)转化前将保存的感受态细胞在冰上融化。2)加入0.5~1μg质粒DNA，同时以无菌水代替DNA作为对照，冰上放置5min。3)液氮中速冻5min。4)取出后立即于37℃保温5min。5)每管中加入800μlYEB液体培养基，28℃恒温摇床缓慢振荡2~4h。6)取200μl菌液涂于YEB（含有Sm和Km）或YEP（含有Cm和Km）的固体筛选培养基上，于28℃恒温培养箱中培养，两天后观察菌落的生长情况。#TE也可以用100mmolCaCl2代替！！！！！外源片段和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：1）足量的载体DNA，以满足j:i1和j:i3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。粘端连接1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。2）按如下所述设立连接反应混合物：a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。b．加水至7.5μl，于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0℃。c．加入10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液1μl，T4噬菌体DNA连接酶0.1Weiss单位，5mmol/LATP1μl，于16℃温育1～4小时3）每个样品各取1～2μl转化大肠杆菌感受态细胞。平端DNA连接T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接，由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：1）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。2）不存在亚精胺一类的多胺。3）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。4）高浓度的平端。在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇或氯化六氨全高钴,可以使如何取得适当浓度的平端的DNA总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大1～3个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。拟南芥和水稻材料培养及转化拟南芥植物材料的培养实验试剂(1)人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合(2)PNS营养液：每升含5ml1MKNO3，2ml1MCa(NO3)2˙4H2O，2ml1MMgSO4˙7H2O，2.5ml20mMFe.EDTA，2.5ml1M磷酸缓冲液（pH5.5），1mlMS微量元素。(3)PNS营养液母液配方：①1MKNO3101.1g②1MCa(NO3)2˙4H2O236.15g③1MMgSO4˙7H2O，246.48g④20mMFe.EDTA：FeSO45.57g，EDTA7.45g。注意先各自配成溶液，再混合。⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：磷酸二氢钾130.4g，磷酸氢二钾9.12g⑥MS微量元素：硼酸0.434g硫酸锰（MnSO4H2O）1.7626gCuSO4˙H2O0.0798gZnSO4˙7H2O0.172gNaMoO4˙2H2O0.0432gNaCl0.585gCoCl˙6H2O0.00129g以上母液均配至1L实验步骤1）当年收获的种子种植后4度春化72h，隔年种子种植后春化24h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗﹑16h光照培养。2）将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。3）将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上，一盆不宜超出十棵。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。22度左右，可24小时光照。4）土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3公分时，剪除顶花絮，用营养液再浇灌一次。5）种子的收集：拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干爆后将拟南芥剪下，放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。拟南芥的转化和转化子的筛选实验试剂渗透培养基（1L）：1/2xMurashige-Skoog；5%蔗糖；0.5克MES；用KOH调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升SilwetL-77）实验步骤1）制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液OD600当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心10分钟。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右。2）先将植株上已长出的果荚及开开的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。3）一周后再喷洒一次。收种子，在相应的抗性平板上筛选转化子。4）转化子的筛选：种子消毒，先用70%乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。5）处理后的种子用Topagar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。6）4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。若已确定为转化子，即可移栽浇过饱和PNS营养液的人工土壤生长。注意事项6-BA母液配制时用乙醇溶解。1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。水稻转化（1）材料的预处理幼胚的处理步骤如下：（a）采集受粉后12-15天未成熟的种子，在这个时期的胚乳相对固化，但仍成乳状。（b）人工去除稃毛和稃壳。（c）将去壳种子在70%－75%乙醇中浸泡1分钟，倒去废液。（d）将去壳种子在33%次氯酸钠中（加一滴吐温80）灭菌2小时，倒去废液。（e）无菌水洗10次，无菌纱布吸干水分。（f）在无菌条件下用手术刀和镊子解剖幼胚。（g）将幼胚直接转入NBD2（2,4D浓度2mg/L）培养基平板中。（h）26℃暗培养4-5天。成熟胚的处理步骤如下：（a）将干种子去壳。（b）将去壳种子在