植物生物工程的应用

植物生物工程的应用20世纪末，人类基因组测序及基因草图的完成是分子生物学的重大进步，它推动了动物、植物和微生物的基因组测序，创立了基因组学这一分子生物学的分支。随着大规模核酸序列测定技术的完善和智能化，在不远的将来基因组测序将成为研究各种生命特征和生物进化规律的基本法法。在21世纪，人类有望完成绝大部分重要生物种类的基因图谱。植物生物工程是以基因工程为核心，利用植物的特性与功能，采用先进技术，以人们的意志或设计更新改造遗传物质，高效地获得预期性状的新物种。一般包括细胞工程，细胞组织培养，基因工程。本文主要介绍植物生物工程在药用和农业方面的应用。药用植物生物工程方面主要是在两个水平上进行研究的：（1）、组织和细胞培养。在濒危物种保护、重要资源快繁、退化种质脱毒改良和次生代谢物生产等领域应用前景广阔。分别从药用植物组织培养的外植体、培养基和培养条件、诱导子、抗逆性、产物药效成分、脱毒培养等方面和细胞培养的培养基和培养条件、高产细胞系的筛选、诱导子、产物药效成分、生物反应器、固定化培养等方面进行了总结研究。（2）、分子标记、遗传转化及功能基因研究。随着生物技术的发展和天然产物开发的不断深入，现代分子生物学研究的先进技术应用于药用植物研究领域，对传统中药的现代化发展起着越来越重要的作用。利用分子标记技术，对于药用植物种属间的亲缘关系多态性和系统树的建立发挥了重要作用；利用农杆菌介导遗传转化技术，可将有重要功能的基因通过基因重组转移到目的植株获得表达；对药用植物重要功能基因的研究将有助于明确这些功能的重要遗传和生理调控功能，为其进一步开发利用奠定基础。就药用植物的分子标记、遗传转化和功能基因研究进行综述。在农业方面主要介绍当时较强的领域应属植物组织培养技术已有10多年的经验，如利用花药培养单倍体已培养出一批水稻，小麦，烟草等新品种；茎尖脱毒快繁已应用于防治马铃薯退化和一些花卉植物。从原生质体或愈伤组织再生完整植株已在烟草，胡萝卜，油菜等获得成功。首先转基因植物的目的涉及到抗病毒，抗细菌，抗盐碱，抗虫，抗除草剂，在改良品质方面包括抗软化，雄性不育，改良营养品质等。1.植物生物工程在药用方面的应用1.1组织和细胞培养植物组织培养(planttissueculture)是指在无菌的条件下，将离体的植物(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(形成层、药花组织、胚乳、皮层等)以及原生质体,培养在人工配制的培养基上,给予适当的培养条件,使其长成完整的植株。通过组织培养,还可生产人工种子。1.1.1发状根培养发根农杆菌属革兰氏阴性细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及个别裸子植物，其Ri质粒能诱导毛状根的产生。近年来药用植物毛状根培养已在26科100多种植物中获得成功。主要在银杏、长春花、青蒿、甘草、商陆、人参、西洋参、何首乌、丹参等珍贵药用植物上获得了许多具有开发价值的次生代谢物，其中药用价值较高的有喹啉类、生物碱类、吲哚生物碱、莨菪烷生物碱、喹啉烷生物碱等、甙类(人参皂甙、甜菜甙)、黄酮类、醌类(紫草宁)、多糖类、蛋白质(天花粉蛋白)、超氧化物歧化酶等。1.1.2冠瘿组织培养通过毛状根获得高产量植物次生代谢物，主要适用于有效成份在根中的植物，对于有效成分在茎、叶等地上部分的植株则不适采用。冠瘿组织的培养不仅能产生原植物根中合成的有效成分，而且还能产生原植物地上部分特别是叶中合成的成分。1.1.3发状根和冠瘿组织共培养由于许多酶的表达具有组织器官特异性,对地上和地下均能合成次生代谢物质的植株，但单纯毛状根培养或单纯冠瘿组织培养均不能合成的物质，可根据毛状根和冠瘿组织具有激素自主性的特点，在同一培养基中进行二者共培养，为某些重要次生代谢产物的生产提供新思路。1.1.3愈伤组织培养愈伤组织再分化可长成完整植株。愈伤组织可作为生物反应器生产天然药用植物有效成分。郑树松等对栝楼的快速繁殖、愈伤组织的诱导及再分化以及不同培养体系中天花粉蛋白的表达进行了初步研究，结果表明：栝楼茎切段的腋芽和顶芽在MS＋0.5、1.0mg/L6-BA培养基上可以快速繁殖；组织培养苗的叶MS+4.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA的培养基上可形成愈伤组织，天花粉蛋白在愈伤组织中可获得一定表达。该愈伤组织在30天后可分化为绿苗，绿苗转MS+0.1mg/LNAA的培养基可100%生根；生根苗移栽至土壤中100%成活。1.2细胞培养细胞培养是生物技术领域里的一个重要分支，通过药用植物的细胞培养，产生重要的次生代谢产物以及进行生理生化和遗传学研究，大部分传统药材的有效成分是次生代谢产物，采用大规模细胞培养是解决濒危药用植物及药效成分低的药用植物满足用药需求的重要途径，细胞培养具有生长速度快、周期短、产物均一可控、药效成分高于天然植物等优点。到目前为止，我国已经从400多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，从中分离出600多种代谢产物，许多重要药用植物如人参、西洋参、丹参、紫草、洋地黄、长春花、红豆杉、冬虫夏草、黄连等植物细胞培养都获得了成功。1.3分子标记、遗传转化及功能基因研究1.3.1分子标记DNA分子标记技术是指通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物体内核苷酸序列与外在表现性状规律的技术，可指导药用有效成分快速方便、正确地寻找与开发利用。分子标记技术在药用植物的群体遗传结构、生态与进化、分类、质量评价等多方面应用广泛。（1）RFLP标记，基本原理是基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生大小不等的DNA片段；它所代表的是基因组DNA酶切后产生的片段在长度上的差异，这种差异是由于突变增加或减少了某些内切酶位点造成的。（2）DNA指纹图谱，具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，成为研究动植物群体遗传结构、生态与进化、分类等很有价值的遗传标记，在中药品质研究、产地分析等领域中发挥着重要作用。目前牛蒡、厚朴、红豆杉、金银花、红曲、西洋参、西红花、蒲公英、苦地胆等多种药用植物和药材进行了DNA指纹图谱研究。（4）RAPD分子标记技术随机扩增多态性(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)是指用合成较短的单个随机引物，扩增药材总DNA，扩增片段具有品种，品系特异性。任冰如等[40]对南北苍术不同居群的亲缘关系进行RAPD鉴定，从分子水平证实南、北苍术亲缘关系很近,差异很小。1.3.2农杆菌遗传转化农杆菌诱导毛状根促进次生代谢；长春花:通过毛状根培养可获得抗癌成分长春碱和长春新碱。1.3.3功能基因研究功能基因研究常用技术及分类：药用植物功能基因研究是从功能基因入手阐明药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，其中主要涉及到次生代谢产物生物调控的关键酶系的结构编码基因和其他功能基因。控制红花刺的基因、甘草种子的抗逆性基因和重要标识基因(信号基因/报告基因)等。研究中可能应用的分子生物技术有植物的表达序列标签(EST)和cDNA文库筛选；药用植物功能蛋白质组研究；特定代谢时期细胞功能簇(CRC)分析和功能蛋白质组表达图谱用于基因组功能提示的可行性；基因表达指纹(GEF)；基因表达系统分析(SAGE)；cDNA3′端限制酶切片段显示；分子指数的RNA指纹(MI)；消减杂交(SSH)；基因芯片等。2.植物生物工程在药用方面的应用2.1利用花药培养单倍体或染色体工程和无性系变异等方法培育利用花药培养单倍体或染色体工程和无性系变异等方法培育并审定了小麦，水稻，油菜，甘蔗新品种18个，累积种植面积达1700多万亩(约120万公顷)，其中单倍体育种有：水稻中花12号,京花101等；小麦京花5号，CA8685；色体工程的有：小麦小偃168，小偃264，无性系变异的双低油菜H166，H155(未发表资料)。2.2植物快繁的生产不论在规模或植物种类都大幅度增加植物快繁的生产不论在规模或植物种类都大幅度增加南方沿海各省已年生产两千多万株的快繁苗供广东，广西，福建，云南，海南等省。中国有200万至250万亩蕉田(约140000-170000公顷)。目前不过15%-20%的蕉田种植组培苗,随着蕉农科学意识的增加,香蕉组培苗的需求将会不断增长。2.3转基因植物转基因植物的目的涉及到抗病毒，抗细菌，抗盐碱，抗虫，抗除草剂，在改良品质方面包括抗软化，雄性不育，改良营养品质等；其次，转化手段如农杆菌Ti和Ri，基因枪，激光，电激，花粉管通道，子房注射等多种转化方法已建立；第三，受体植物已从模式植物烟草扩展到重要粮食和经济作物，水稻，玉米，棉花，番茄，辣椒，木瓜，甜菜，大豆甚至木本的杨树。例如以大豆大豆为例，用含NPTⅡ和GUS嵌合Ti质粒的农杆菌转化大豆主栽品种“中豆Ⅱ”未成熟的完整子叶，在诱导培养基上可高频率地产生胚状体，在含Kan的MS培养基上使胚状体进一步发育成苗。经检测NPTⅡ和GUS的表达后证实已获得转基因大豆,频率可高达60%-70%。转化来自未成熟子叶的原生质体其转化再生率达3×103以上，如此高频率未见报导。研究生课程论文（作业）封面（2011至2012学年度第一学期）课程名称：植物生物工程课程编号：9.506学生姓名：翁月学号：1109767年级：11级硕士5班任课教师:朱延明提交日期：2012年2月24日成绩：__________________教师签字：开课---结课：第4周---第16周评阅日期：年月日东北农业大学研究生部制