搜索
研究生课程论文题目：PCR-DGGE在真菌研究中的应用学院生命科学学院课程名称植物学科研究进展专业年级植物学2014级学号20141069姓名成斌2015年1月20日-2-PCR-DGGE在真菌研究中的应用成斌（河北大学生命科学学院河北保定071002）摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）在真菌研究中技术应用的主要步骤：从样品中直接提取真菌DNA，选取5′端含GC夹的特异性引物对18SrDNA或IST序列等的部分片段进行扩增，得到合适的目的DNA片段，并在变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使不同来源的真菌DNA片段有效分离，再进行各种分类分析。关键词:PCR-DGGE；变性梯度凝胶；真菌；引物；DNA丛枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi,AMF)在自然界分布广泛,能够与80%以上的陆生植物形成共生体[1-2]。它能够提高植物抗旱性、抗病性,促进生长,提高产量,改善作物矿质营养,被誉为“生物肥料”[3]。由于AM真菌至今仍然不能被纯培养,给菌种鉴定、遗传学以及群落生态学研究等带来不少难题[4]。随着分子生物学技术的不断发展,各种分子技术已被应用到AM真菌研究中。目前,国外已在这一领域进行了大量的探索和研究,而国内在该领域研究则进展缓慢[5]变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）是在含有浓度线性递增变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，将具有不同碱基序列而长度相似的双链DNA分离[8]。变性梯度凝胶电泳技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术[7]。后来,该技术逐渐被应用于微生物生态学研究,并证实了这种技术在研究自然界微生物群落结构变化、遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性,并且该方法能够较准确地反映出环境样品中优势种群的动态变化规律[8-9]。目前,在原核生物生态学研究中DGGE技术已发展的较为成熟。然而,将其应用于真核生物生态学研究的报道,并不多见[5]。1样品DNA的提取从样品中提取DNA的产率，直接决定了DGGE条带的代表性[14]。DNA产率低，其条带的代表性就差。真菌分布广泛，种类繁多，为获得较高的DNA提取产率，DNA提取方法也需要根据样品的特性具体分析，寻找针对性较强的处理方法。1.1土壤样品中真菌DNA的提取对于土壤样品DNA的提取，通常会采用改良后的Bead-Beating法[5]。具体方法是：称取10g土样，放入盛有数粒无菌玻璃珠（直径3～5mm）的三角瓶中，加15mL提取缓冲液；在180r/min，37℃条件下振荡30min后，加2mL20%SDS继续振荡10min；65℃水浴1h后，6000×g离心15min；收-3-集上清液，加0.5倍体积PEG(30%)-NaCl(1.6mol/L)，混匀后室温下静止2h，在10000×g离心20min，沉淀用2mLTE重新悬浮；加4mol/LNaAC至终浓度0.3mol/L，用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，0.6倍体积异丙醇沉淀2h，12000×g离心20min，沉淀干燥后，200μLTE溶解，经纯化后，-20℃保存。1.2液体样品中真菌DNA的提取对于液体样品，需要首先进行离心，将收集的沉淀物重新溶解后，即可进行DNA提取操作。对于DNA提取前的预处理，可选用常规方法，如机械研磨法、酶解制备原生质体法、氯化苄法等[15]，需根据不同样品的具体特征进行选择。DNA提取完毕后，可以通过电泳进行检查，或者利用紫外可见分光光度计检查DNA的纯度[14]。如纯度不够，可以利用纯化试剂盒做进一步的纯化。1.3丛枝菌根样品中真菌DNA的提取丛枝菌根真菌在自然界分布广泛，大量存在于农田、森林、沙漠、煤渣、盐碱地、贫瘠土壤等生态环境中，能够侵染约80%的陆生植物[16]，与根系共生形成丛枝菌根。丛枝菌根真菌DNA的提取，可以Saito等人[17]开发的方法为基础，稍加改进即可获得较为理想的效果。基本过程为：取丛枝菌根样品1.5g左右，冲洗干净后剪成约0.5cm长的碎段放入研钵中，加入约1.0g石英砂，充分研磨，加4mL1mol/LTris-HCL（pH8.0），移入10mL离心管中；沸水浴15min，8000×g离心15min，上清液加4mol/LNaAC（pH5.4）至终浓度0.3mol/L，0.6倍体积异丙醇沉淀2h，14000×g离心10min，弃上清液；沉淀物用1mL70%乙醇漂洗一次；用100μL无菌水溶解沉淀，在-20℃保存。1.4真菌孢子DNA的提取采用湿筛法[18]获取孢子。由于孢子即为细胞，所以样品的处理并不复杂，只需破坏其细胞壁，即可进行基因组总DNA的提取。采用石英砂震荡破壁再进行提取可能获得较为理想的提取效果[19]。1.5霉菌DNA的提取霉菌DNA的提取，可采用改良的氨苄法[20]。具体操作步骤：取液体培养20h的菌液各1.5mL，在水浴式超声波破碎仪中超声处理3min，12000r/min4℃离心12min；弃去上清液，收集菌体，在菌体中加200μLTE提取液（100mmol/L的Tris-HCl（pH9.0）、40mmol/L的EDTA（pH8.0）），在旋涡混合器上充分振荡使之充分混匀后，再加入40μL10%SDS、120μL氯化苄，在旋涡混合器上剧烈振荡，至管内混合物呈乳状；置于50℃水浴1h左右，每10min振荡混合一次，直到溶液变黏稠；加入120mL3mol/LNaAC混匀，冰浴15min，12000r/min4℃离心12min，弃去沉淀；上清液加入等体积的异丙醇，缓慢混匀，室温沉淀20min（有细丝状沉淀出现），12000r/min离心10min；沉淀物在无菌操作间自然干燥30min左右，再溶于50μLTE中（10mmol/L的Tris-HCl（pH9.0）、1mmol/L的EDTA（pH8.0）），置-20℃保存备用。-4-2PCR扩增在PCR扩增中，引物的选择、扩增程序和PCR产物的质量都可能造成群落结构的分析偏差，因此需要慎重对待。2.1引物的选择对于特定微生物种群或类群的DNA扩增，需要根据其分类等级的DNA特征，设计相应的具有特定碱基序列的引物。对于真菌，目前常采用18SrDNA和IST序列的部分片段进行DNA扩增。18SrDNA序列具有很高的保守性，适用于种以上分类界元（包括：界、门、纲、目、科、属、种）的不同生物类群间的系统分析[21-23]。ITS区为非翻译区，序列多态性较广泛，适用于不同种和不同亚种的生物种群的系统分析[24,25]。18SrDNA常用的通用引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS8、NS9、18SF和18SR，ITS常用的通用引物包括ITS1、ITS2、ITS3、ITS4、ITS1-F、ITS4-B等[26]。也有采用26SrDNA序列的部分片断作为通用引物的例子[27]，如NL1、NL4等。表1给出了几种真菌常用的引物序列。表1真菌常用引物真菌种类引物引物序列参考文献担子菌与子囊菌(Basidiomycota&Ascomycota)ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGC[24]ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCITS7GGAAGGTAAAAGTCAAGG真菌菌根(Mycorrihiza)ITS1-FCTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA[25]ITS4-BCAGGAGACTTGTACACGGTCCA担子菌(Basidiomycota)NS1GTAGTCATATGCTTGTCTC[25]NS8TCCGCAGGTTCACCTACGGA假丝酵母(Candida)PR3FATTGGAGGGCAAGTCTGGTG[26]PR3RCCGATCCCTAGTCGGCATAG子囊菌(Ascomycota)NL1GCATATCAATAGCGGAGGAAAAG[27]NL4GGTCCGTGTTTCAAGACGG对于长度超过500bp的DNA片段，常规的DGGE电泳技术只能有50%的检出率[21]。采用在引物上连接“GC夹”的方法，可显著提高PCR产物质量，从而提高DNA片段的检出率[28]。2.2扩增程序扩增程序一般包括预变性、变性、退火和延伸几个主要过程。为了提高扩增产物质量，需要根据拟扩增DNA片段的长度，确定适宜的反应体系、反应时间、反应循环数和反应温度等。其中，退-5-火温度的确定在各影响因素中最为关键，可通过温度梯度PCR试验进行确定[29]。2.3扩增产物的检查对于PCR产物的检查，采用琼脂糖凝胶电泳进行。需要注意，常用染料溴化乙啶（EB）为致癌物质，可以用Goldview染色替代。Goldview有与EB相同的灵敏性，且安全无毒[30]。3DGGE3.1DGGE药品的准备目前，真菌DGGE技术多采用双梯度法（即聚丙稀酰胺和变性剂为2个梯度）以减缓条带的进一步迁移，提高分离效果[31]。聚丙烯酰胺浓度范围一般为6～12g/100mL；而变性剂尿素和去离子甲酰胺的梯度一般选取40%～55%这个区间（可根据不同的需要进行调整）。另外，制备凝胶还需要过硫酸铵以及TEMED。3.2DGGE凝胶的制备凝胶制备步骤繁琐，一般包括以下步骤：擦净玻璃板，组装梯度生成装置，进胶，插上梳子，试漏检验，凝胶，清洗用具。其中每一步操作都可能对电泳质量产生显著影响，因此整个过程均需精心操作。3.3电泳在胶凝固好之后，即可进行电泳操作。首先将电泳槽中的液体预热到设定温度，将玻璃板与凝胶板架固定好同时检查并确认无漏水现象，将凝胶板架、温度控制系统以及电泳槽组装好，接通电源，当温度再次加热到所需温度时，关掉所有电源，拔掉梳子进样；然后再将温度控制装置再次组装好，接通温控器电源，温度调致所需，打开heat键，运行5min后，打开电泳仪电源以及bump键，调节电压到所需，调节时间。3.4染色及成像电泳完毕后，剥胶染色。银染法和采用SYBRGreenⅠ等新型染料的染色法，均可获得较为理想的染色效果，但SYBRGreenⅠ等新型染料价格昂贵，因此前者更为常用。将凝胶染色后，采用凝胶成像仪扫描，即可获得用于微生物群落分析的DGGE图谱。3.5条带分析及回收DGGE图谱可以采用Quantityone（Bio-rad）软件进行分析，从中可以获得优势菌群及群落结构的基本信息。对于凝胶上的特异性DNA条带，可以进行切割回收，PCR扩增后测序。通过Blast软件，将获得的序列与GenBank进行比对，并下载最相近的序列，以phylip软件按最小相邻法构建系统进化树，通过RDP数据库，可寻找到最相近的种属。-6-4PCR-DGGE在真菌群落分析中的应用前景利用PCR-DGGE技术，可以对来源于环境中的微生物进行功能基因甚至是基因组学的研究，并可以同时分析多个样品，因此该技术成为目前监测微生物群落动态的一种强有力的工具[32]。通过该项技术可以获得比较全面的不同环境中的真菌及各类微生物的相关信息，包括环境中存在着的许多不可培养但具有很高利用价值及开发利用前景的菌种，对其进行分析研究，了解他们的生物学特性，将对未来产生重要的意义。与AFLP、FISH其它分子生物学技术的结合后，必将进一步发挥DGGE技术的效能，更好地为微生物物群落结构和功能分析服务。参考文献[1]FischerSG,LermanLS.LengthindependentseparationofDNArestrictionfragmentsintwo-ditmentionalgelelectrophoresis[J].Cell,1979,16:191-200.[2]PedroMS,HarutaS,HazakaM,etal.Denaturinggradientgelelectrophoresisanalysesofmicrobialcommunityfromfield-scalecompost[J].BiosciBioeng2001,91:159-165.[3]ArayaR,TaniK,TakagiT,etal.Bacteria