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植物组织DNA的提取、分离基础生物化学实验学时：82009年11月2日1、学习并掌握用CTAB法提取植物总DNA的原理和方法。一、实验目的：2、学习并掌握核酸组分的分离技术——琼脂糖凝胶电泳方法核酸在植物体内多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在，因此提取分离核酸时，必须使核酸与蛋白质解离，并除去蛋白质和多糖等杂质。本实验先将植物材料速冻、研磨，破碎细胞壁，然后加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）分离缓冲液，使细胞膜破裂，同时将核酸与蛋白质及多糖等杂质分开。一定浓度的CTAB与核酸结合形成复合物，该复合物溶于高浓度的盐溶液，（而在低盐溶液中沉淀）再经氯仿－异戊醇抽提、离心，除去蛋白质等杂质，上清液中加入异丙醇，沉淀DNA，而CTAB溶于异丙醇。二、实验原理:琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持介质的一种电泳分离方法。它主要用于大于或等于1Kb核酸的分离。有电荷效应和分子筛效应。其迁移率的大小，主要与DNA分子大小和空间构象有关。其次，凝胶浓度、电泳电压、PH值也会影响迁移率。核酸区带观察，是利用核酸与EB结合，在紫外光下可发出橙黄色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进行。1、实验材料：三叶草叶片2、仪器：(1)电热恒温水浴锅(2)离心机(3)液氮罐(4)研钵等三、实验材料、仪器和试剂：3、试剂：（1）CTAB分离缓冲液：2%CTAB，1.4MNaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl(pH8.0),0.2%巯基乙醇共100ml（2）洗涤缓冲液：75%乙醇，100mM乙酸铵共100ml（3）氯仿：异戊醇＝24：1（V/V）（4）异丙醇（5）TE液（6）液氮（7）EB液（8）电泳缓冲液TBE（9）凝胶加样缓冲液（一）植物组织DNA的提取：1、取10mlCTAB分离缓冲液加入离心试管中，于60℃水浴预热。2、称取1.5g新鲜叶片于预冷的研钵中，加入液氮，迅速将叶片研磨成很细的粉末。3、将叶片粉末直接加入预热的CTAB分离液中，轻轻转动混匀，60℃水浴保温30分钟。4、将液体转入小烧杯中，加入等体积的氯仿－异戊醇，轻轻摇匀后，分装到两个离心管中，等重，4000r/min，离心8分钟。5、用大开口滴管取出上层水相于另一洁净的离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，使DNA沉淀，并与CTAB分离。（注意现象）四、实验步骤：6、收集DNA：（1）如呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒（或小勺）轻轻搅起。（2）如呈云雾状，再2000r/min离心4min，小心倒去上清液。7、洗涤：（1）将丝状DNA直接转移到15ml的洗涤缓冲液中洗30分钟（如不能搅起，可2000r/min离心10分钟，转速不宜太高，否则形成坚实的沉淀）；（2）在松散的沉淀物上加入15ml洗涤液，洗涤30分钟，用玻璃棒轻轻搅起沉淀。8、保存：将DNA从离心管中取出，于滤纸上干燥后溶于1mlTE中，低温保存备用。(二）DNA组分的分离——琼脂糖凝胶电泳1、琼脂糖凝胶的制备：以5XTBE电泳缓冲溶液配制，浓度为0.7%。将琼脂糖粉和TBE液于沸水浴中加热至完全溶解，待冷却至60℃左右时加入EB，使EB终浓度为0.5mg/ml。2、凝胶板的制备：A、在胶床的两头贴上胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置于水平台面上。B、插入梳子，梳子下端距底板0.5-1mm，然后将凝胶不间断地倒入胶床，高3-4mm，避免产生气泡，在室温下凝固。C、完全凝固后撕去胶带，于电泳槽中加入电泳缓冲溶液，高于胶面1mm，从一端斜拉出梳子，除去产生的气泡。3、加样：将样品DNA溶液与加样缓冲溶液以5：1体积混合，加样量每孔5-10ul。4、电泳：阳向极电泳。电位5V/cm，当染料前沿移至底边1-2cm处时,停止电泳。5、观察：将胶床置紫外检测仪上观察并记录。五、思考题：1、提取核酸时应注意些什么问题？2、EB在对核酸进行染色时有什么优点？其原理如何？3、用中文命名：CTAB、EB。1、核酸提取过程中的注意事项：（1）避免过酸过碱或高温环境，合适的T：0－4℃，pH4-9；（2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；（3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂－EDTA，柠檬酸钠；（4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，降低，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。终于下课了！！