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第一章绪论(2学时)教学目的与要求:通过本课学习使同学们了解植物组织培养的概念,分类,简史,特点,用途,发展方向等内容.1.1植物组织培养的基本概念和类别广义的植物组织培养(planttissueculture)泛指在无菌的条件下,将离体的植物器官(如植根,茎,叶,花,果实等),组织(分生组织,花药组织,胚乳,皮层等),细胞(体细胞,性细胞)以及原生质体等,培养在人工配制的培养基上,给予适当的培养条件,使其长成完整的植株的过程.由于培养的对象大多是脱离植物母体的外植体,培养的器皿一般是在试管内,所以植物组织培养也叫离体(体外)培养(cultureinvitro)或试管培养(cultureintest-tube).以往由于植物组织培养的对象多是从植物体上获取材料后,再将材料切成小块的组织而用于培养,培养结果也多是形成愈伤组织,因此,将对植物小块组织的培养——即对植物组织的培养(cultureofplanttissue)狭义地称为植物组织培养.随着体外培养这门技术的发展,植物组织培养技术亦因所培养对象的结构层次不同,培养结果不同而派生出若干分支.1.1.1根据培养的对象划分植物组织培养最初就是指愈伤组织培养.但发展至今,其范围日益扩大,已包括植物体和它高度组织化的离体器官,组织,复杂的多细胞和原生质体的离体无菌培养.因此,从培养对象上来看,可将其分成几种不同水平的培养,即整体的,器官的,组织的,细胞的和原生质体的培养.⑴植株的培养植株的培养(cultureofplant)是指将幼苗及较大植物体放在无菌的人工环境中让其生长发育的方法.植株培养一般是作为植物组织培养的中间环节,如再生植株的继代培养,壮苗培养等;也用于植物的种质保存,如某些名,优,新或濒危植物的体外慢生长保存.⑵植物胚胎的培养植物胚胎的培养(cultureofplantembryo)是指将植物成熟或未成熟胚放在离体的,无菌的人工环境中让其生长发育的方法.由于植物的胚是包含在胚珠和子房里,因而进行胚胎培养时,常常是取胚珠和子房放在培养基上,使其内的胚进一步生长发育.胚胎培养的方法也可用于离体受精后形成的杂种胚培养和体细胞诱导出的胚状体培养.⑶植物器官的培养植物器官是指在植物体上由各种组织构成的,行使一定功能的结构单位.植物的器官有两种:营养器官和生殖器官.根,茎,叶是植物的三大营养器官,花,种子,果实是植物的生殖器官.植物器官的培养(cultureofplantorgan)指的是以植物的根,茎,叶,花,种子,果实等器官的组织切块(切块既可是部分器官,也可是部分组织)为外植体,使之在离体的人工无菌环境中进行生长发育的方法.植物器官培养强调的是外植体的器官类别,培养时可用整体器官,也可用器官切块或切段.不同植物的同一器官有不同的培养结果,同一植株的不同器官也有不同的培养结果.这一点在应用植物组织培养技术时相当重要.⑷植物组织的培养植物组织是指在发育上有着共同来源,在结构上相似并且共同完成一定的生理功能的细胞群.植物的组织有六种:分生组织,基本组织,保护组织,输导组织,机械组织及分泌组织.植物组织的培养(cultureofplanttissue)是指将植物体的这些组织或组织切块,放在离体的无菌环境中让其生长发育的方法.由于离体培养的组织块大多是先脱分化形成愈伤组织,而后再进一步生长分化,因此也将植物组织的培养定义为愈伤组织的培养.愈伤组织培养(callusculture)是指使一个细胞,一块组织或一个器官的细胞,通过脱分化形成愈伤组织,并再分化成植株的方法.植物组织的培养一方面强调的是外植体在组成上的均一性,另一方面强调的是培养结果,强调愈伤组织的形成.若是强调愈伤组织的形成,则外植体可以是一个细胞(原生质体),一团细胞,一块组织甚或是一个器官.从这一点上来讲,植物组织的培养也包含有植物的器官培养和植物的细胞及原生质体的培养.由于进行植物组织培养时,除特殊情况外并不强调外植体的组织的均一性,大多情况下,组织的均一性与培养结果也没有必然联系,因此植物组织的培养只是指愈伤组织的培养.植物组织的培养也可用于指以愈伤组织作为外植体的各种培养.⑸植物细胞的培养植物细胞的培养(cultureofplantcell)是指将植物材料从母体植株上切取后,分离成细胞或小细胞团,放在无菌的人工环境条件下使其生长发育的方法.植物细胞培养强调的培养对象是游离细胞或细胞团,培养时可用一群细胞,也可用单个细胞.植物细胞培养也可用于指原生质体再生壁后的细胞培养.⑹植物原生质体的培养植物原生质体的培养(cultureofplantprotoplast)是指将植物的细胞去除细胞壁后形成裸露的原生质体,把原生质体放在无菌的人工环境条件下使其生长发育的方法.1.1.2根据培养基的物理状态划分根据培养基中是否加人凝固剂可将植物组织细胞培养分为固体培养和液体培养两种不同的培养方法.固体培养(mlidculture)指在液体培养基中加入0.5%～1%的琼脂使液体培养基固化,再接种培养物的培养方法.液体培养(Iiquidculture)指在不加凝固剂的液体培养基中直接接种培养物的培养方法.根据所用培养液的量的不同,又可将液体培养分为液体悬浮培养和液体浅层培养;还可根据液体培养时培养瓶的放置情况,将液体培养分为液体静置培养,液体旋转培养,液体振荡培养等.1.1.3根据培养结果划分根据培养结果不同,将植物组织细胞培养分为愈伤组织培养,胚状体培养和再生植株培养三类.愈伤组织培养(callusculture)是指从外植体上直接诱导出愈伤组织的培养.愈伤组织在植物组织培养中的用途非常广泛,既可以作为植物组织培养的原材料和进一步培养的材料,例如,作为原生质体游离的材料,悬浮培养细胞的材料,胚状体诱导的材料等;也可以作为培养的终产物用于研究,譬如,可作为植物组织细胞次生代谢物提取的原料.胚状体培养(embryoidculture)是指从外植体上直接或间接诱导出胚状体的培养.胚状体的获得是进行植物组织培养的主要目的,胚状体一方面可作为人工种子胚的来源;另一方面也是快速繁殖植物的主要途径.再生植株培养(replantculture)是指从外植体上通过各种途径直接或间接诱导出再生植株的培养.再生植株的获得是植物组织培养的最终目的.一般来讲,只有将外植体诱导出再生植株才算获得植物组织培养的真正成功.1.1.4根据培养方式的不同划分根据培养手段不同,还可将植物组织培养分为四种类型:①试管嫁接(test-tubegrafting),指在无菌条件下,用显微操作法将仅带1—3片叶原基的茎尖(约1mm)取下,然后将此茎尖嫁接于在试管中培养的砧木上的技术;②试管受精(test-tubefertilization),指在无菌条件下,将未受精的雌蕊,胚珠或子房和花粉同时放在人工配置的培养基上生长,使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠,在试管内完成受精过程而获得有生活力的种子的技术;③试管加倍(test-tubedoubling),指在无菌条件下将获得的幼小植株放在加入一定化学物质的培养基上培养,在化学物质的作用下,幼小植株细胞的染色体数可加倍的技术;④试管育种(test-tubebreeding),指植株在离体培养的条件下,通过人工诱变,进行新品种选育的技术.1.2植物组织培养技术的发展简史植物组织细胞培养作为一门技术科学,起始于1902年Haberlandt最早发表的关于植物叶细胞培养的工作以及细胞全能性理论的提出.以后,经过各国科学家的努力,使植物组织细胞培养不仅在技术上不断完善和提高,而且对全能性理论的实质及实现途径有了更加清楚的认识,也使其理论得到了广泛的证实.植物组织细胞培养现已成为一项极其普遍的应用技术,并且逐渐成为植物育种,植物及植物产品工厂化生产,植物医药生产的有力手段.下列主要从植物组织细胞培养的原理和技术方面介绍其发展简史.1.2.1植物组织细胞培养技术的创立阶段植物组织培养的兴起与细胞生物学的发展紧密相关.1667年细胞的发现,1756年愈伤组织概念的提出,1838年植物细胞学说的创立等都为植物组织培养的兴起起到了促进作用.植物细胞学说的主要观点是:植物细胞是植物体的基本结构单位,由它构成整个植物体,同时植物细胞又是具有发育潜能的功能单位,即植物细胞如果存在于与有机体内一样的环境条件时,每个植物细胞都应该能独立生长和发育.根据这一观点,Haberlandt认为高等植物的组织和器官可以不断分割直到单个细胞,如果每个细胞都有植物体一样的性质和能力,那么就可以将植物的单个细胞从母体植株上分离出来,通过体外培养技术,而形成一个新的植物体.Haberlandt大胆地提出了植物细胞具有全能性(totipotency)的观点.他提出的这一观点阐明了一个植物体内所有活的细胞,在离体条件下可以逐步失去原有的分化状态,转变为具有分化能力的胚胎细胞,增殖而分化成完整植株的潜在能力.他在提出这一观点的同时,也进行了一些尝试性的试验,如用高等植物的叶肉细胞,雄蕊细胞,气孔的保卫细胞等材料进行离体无菌培养,培养基为Knop溶液添加I%～3%蔗糖,1%～4%天冬氨酸.结果,有些细胞虽然生活了较长时间,甚至增大,但始终未能发生细胞分裂和增殖.这是不难理解的,因为当时培养技术尚未完全建立.同时,对细胞本身的性质和培养时所需要的营养条件,环境条件的知识,也还不够了解.在植物细胞具有全能性的观点影响和启发下,人们尝试将植物的器官,组织或细胞从母体植株上取下,放在体外的人工设计的无菌环境中让其生长发育,以了解这些器官,组织或细胞的生长发育的规律,以及掌握控制其生长发育过程的条件和因素.一些有代表性的工作如下:Hanning(1904)以萝卜和辣根的胚为培养材料,放人无机盐溶液与有机成分的培养基上培养,结果发现离体胚均可充分发育并能提早萌发形成小苗,首次获得胚培养成功.Robbins(1922)用豌豆,玉米和棉花的茎尖作培养材料,切取1.45～3.75cm长的茎尖,放在无机成分添加各种糖的培养基上培养,结果茎尖发育长成为一些缺绿的叶和根.Laibach(1925)以亚麻种间杂种幼胚为培养材料,成功地诱导了杂种幼胚的发育,并得到了杂种植株.我国学者李继侗等(1933)也曾以银杏胚为培养材料进行离体胚培养,结果发现,3mm以上大小的胚在离体条件下可正常发育,并生长成为植株;还发现银杏胚乳提取物能促进银杏离体胚的生长.这一发现对后来使用植物胚乳汁液或果实的提取液以促进培养组织的生长发育具有启蒙的意义.在20世纪30年代以前进行的植物组织培养,主要使用的是较大的培养材料,如胚胎,茎尖等,所用培养基也较简单,主要是无机盐溶液和有机糖类,因而培养的效果并不明显.这就提示人们需要改进培养基的成分,才能使离体培养获得真正的成功.White(1934)在无机盐和糖类的培养基中加入了酵母抽提物,以番茄根尖切段为材料,进行了离体培养,结果发现离体根在此培养基上可生长,并继代培养了400余天,建立了第一个活跃生长的无性繁殖系.另外,Gautheret(1934)在含Knop溶液和葡萄糖的培养基中加入了水解酪蛋白(caseinhydrolysate,CH),以山毛柳,黑杨的形成层组织为培养材料,发现形成层组织可被诱导形成愈伤组织,愈伤组织不断增生几个月后,形成类似瘤状的突起物.White(1937)发现B族维生素对培养的离体根的生长具有重要作用.同时,还发现吲哚乙酸(indoleaceticacid,IAA)在控制植物生长中的作用.他们的这些工作启发了人们在进行植物组织培养时,在培养基中加入这些因子,以促进培养材料的生长发育.Gautheret(1938,1937)在培养柳树形成层时,在培养基中加入了IAA,结果发现IAA能促进柳树形成层生长,并诱导形成愈伤组织.Nobecourt(1938,1937)在培养胡萝卜根的小外植体时,在培养基中也加入了IAA,结果发现其中央髓部细胞的分裂活性很强,细胞增生甚快,把其转入新鲜培养基上继续培养,4～6周转接1次,可无限发生细胞增殖,形成大量的愈伤组织.这