植物细胞组织培养技术实验指导书

T植物细胞组织培养技术实验指导书中国计量学院生命科学学院二零零六年七月《植物细胞组织培养》实验指导1目录实验一、植物组织培养培养基母液的配制实验二、植物组织培养的培养基配制实验三、康乃馨的离体快繁实验四、胡萝卜愈伤组织的建立实验五、组织培养物的继代培养2实验一组织培养基母液的配制一、仪器及药品冰箱、天平（0.0001g）容量瓶:1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1mol/L盐酸、1mol/LNaOH几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品蒸馏水二、方法和步骤：按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下：大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液l00ml或50ml。微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1LN6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）2.78g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5ml。3有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含0.1-2mg，配制培养基时按所需要的量分别加入，本实验中的2,4-D和6-BA均配成1mg/ml的母液。在配制吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1mol/LNaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。表1N6朱至清(1975)培养基配方药品名配方量(mg/L)母液倍数称取量(g/L)(NH4)2SO4大量元素46310×4.63KNO3283028.3CaCl2·2H2O1661.66MgSO4·7H2O1851.85KH2PO44004.0Na2-EDTA铁盐37.3100×3.73FeSO4·7H2O27.82.78MnSO4·4H2O微量元素4.01000×4.0ZnSO4·7H2O3.83.8H3BO31.61.6KI0.80.8盐酸硫胺素(VB1)有机物质11000×1.0烟酸0.50.5盐酸吡哆醇(VB6)0.50.5甘氨酸2.02.04各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。三、注意事项1.如药品所带结晶水不同，应进行换算。2.因常用的MS培养基中硝酸铵(NH4NO3)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本实验采用N6培养基替代MS培养基。5实验二培养基的配制一、仪器设备及试剂电炉天平（0.0001g）高压灭菌锅量筒：l0ml、20ml、100ml、500ml烧杯：1000ml、500ml、250ml移液管：1ml、2ml、5ml吸管若干、记号笔三角瓶或试管、试管架锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。蒸馏水、pH试纸蔗糖、琼脂等1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。二、方法和步骤1量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基,先量取约700ml体积的水。2根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。物质加入体积或重量大量元素母液(10×)100ml微量元素母液(1000×)1ml有机物质母液(1000×)1ml铁盐母液(1000×)10ml蔗糖30g琼脂8g6吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如本实验中培养康乃馨侧芽或茎段时就加入1ml的1mg/ml的6-BA；而另一个实验胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1mg/ml的2,4-D。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。3调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定培养基的pH按照培养材料的要求分别用1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。4分装将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。5培养基的灭菌一般用手提式医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采用全自动高压灭菌锅。6培养基的保存消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。三、注意事项激素应在调节pH之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响培养质量。在本次实验中将下次实验所需的其它材料一同灭菌处理。7实验三康乃馨的离体快繁一、仪器设备和试剂超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水培养基N6+1mg/L6-BA剪刀、枪型镊子量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试管苗等二、实验材料康乃馨枝条三、方法和步骤1外植体灭菌取从市场上购买的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗30-60分钟，然后在无菌室（超净工作台）内用70%酒精浸没20-40秒钟（根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间。用0.2%的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。2接种先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。超净工作台消毒开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70%的酒精棉球擦净工作台。接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。3培养条件：25℃光照13小时/天光强1000Lux4继代培养（见下一个实验）5诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N6培养基诱导生根6试管苗移栽〈参见有关其它实验〉8实验四胡萝卜愈伤组织的建立一、材料和设备超净工作台或者无菌接种室培养基N6+2mg/L2,4-D带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水解剖刀、枪型镊子、刀片无病虫的胡萝卜直根数十个消毒剂0.2%的升汞溶液70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球l000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔、小刷子（可用一次性牙刷）二、实验材料新鲜胡萝卜、胡萝卜愈伤组织三、实验步骤'1选择无伤、无病、形状较规则的胡萝卜，用小刷子在流动的自来水下洗刷胡萝卜，除净表面所有的泥屑。可以根据实验的时期，选用其它的实验材料。2将胡萝卜切成大约40mm厚的片段,放入100或500ml的烧杯中，倒入消毒液，将植物材料覆盖、浸泡10-30min。在灭菌过程中，在每个材料上做好标记，并对应地放在预接种的培养基边上。接种后在培养瓶上标明培养物名称和培养日期。3在超净工作台上，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5次，以便去除残留的消毒液。4取消毒过的胡萝卜放入已灭菌的带有滤纸的培养皿中，用无菌解剖刀从两端各切去10毫米，再将留下的胡萝卜直根切成一系列一毫米厚的横切片。取其中的一片转到另一个已灭菌的带有吸水纸的培养皿中，再将每一片切成小块，使其每个小块上均包含木质部、形成层和韧皮部，外植体的大小要尽量一致。5接种取下培养瓶的塞子（或锡铂纸），用火灼烧瓶口2cm处，手持培养瓶呈45º角，用消毒镊子把4-8块外植体转到琼脂培养基的表面，注意把靠近根尖的一面接触培养基。然后立即将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口。每两次转移9之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌。6培养接种好的外植体在25℃的培养箱中，黑暗条件下培养四周左右就会形成一块较大的愈伤组织。10实验五组织培养物的继代培养一、材料和设备材料从培养4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体超净工作台培养基N6+0.5mg/L2,4-DN6+2mg/L6-BA（也可以自已设计）三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶二、方法步骤1取材在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶培养物，灼烧培养瓶口约20毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培养皿中。每个培养皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织。把每块愈伤组织分成两、三个不小于5mm见方的小块。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状,不适宜作继代培养。这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。每次操作后要去掉用过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。2继代转接将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上，接种方法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。长期培养的胡萝卜组织会产生大块愈伤组织。正在发育的愈伤组织作第一次继代培养所用的实验程序与以后每隔四周转移一次建成愈伤组织系的继代培养程序相同。3实验记录将实验记录抄录于笔记本上，注明实验开始的日期、持续期、培养物的数目、污染数目和所作的不同处理。在四星期内，每隔一星期用肉眼观察培养物，记录培养物形态的变化,培养物的生长状态、鲜重变化等，必要时作拍照记录。思考题及作业：1愈伤组织是从刚分离的外植体的哪些区域起源的？2所有的外植体的生长速率都相同吗？3根据每组的实验结果撰写一份完整的实验论文形式的实验报告，实验报告将作为平时成绩记入总成绩。