植物耐盐基因工程研究进展

植物耐盐基因工程研究进展盐害是影响植物生长和作物产量的主要因素,是世界上作物减产的主要原因,盐害导致平均亩产降低50%以上。世界上盐碱土的面积很大,约有4亿公顷,占灌溉农田的1/3。在气候干燥的半干旱、干旱地区由于降雨量少,蒸发剧烈,盐分不断积累;海滨地区由于海水倒灌造成土壤含盐量增加。我国盐碱土主要分布于西北、华北、东北和滨海地区,随着大棚面积的逐年增长和栽培年代的推移,土壤盐渍化日趋严重[1]。盐害限制植物细胞从土壤中吸收水分,引起渗透胁迫,还使植物细胞中的离子浓度增加从而产生离子胁迫。植物为应对不利于生存和生长的环境有很多保护机制,可以防止水分流失和离子毒性[2]。目前已开发了很多可用于提高植物耐盐性的基因工程方法[3]。本文对近年来植物耐盐性的基因工程研究做一个简要总结。1利用植物信号传导蛋白基因提高植物耐盐性植物应答逆境,会产生一系列信号过程,包括Ca2+介导的信号应答和乙烯信号应答等,这就需要多种蛋白激酶的参与。Ca2+在植物适应环境及发育过程中是一个重要的信使,钙联蛋白的感受蛋白分子可以检查和传导细胞间的Ca2+信号[4,5]。乙烯对植物生长和发育的多个方面有重要影响,乙烯信号途径在盐胁迫条件下对植物有一定的保护作用[6]。近年来的研究结果说明过量表达Ca2+介导的信号应答和乙烯信号应答途径的一些蛋白激酶[4~13]可以提高转基因植物的耐盐性。1.1过量表达盐敏性途径相关基因增加转基因植物的耐盐性过度盐敏性(saltoverlysensitive,SOS)途径中包括三个蛋白组分SOS1,SOS2,SOS3。sos3基因编码一个EF手型Ca2+感受器(SOS3),SOS3可以激活Ser/Thr蛋白激酶SOS2,SOS1是一个定位在胞膜上的Na+/H+泵,sos1也是SOS2和SOS3复合体的下游目的基因[7]。其中,SOS2也叫蛋白钙调神经磷酸酶B样蛋白(calcineurinB-like,CBL)家族,是植物特有的一类Ca2+感受蛋白,调控一种蛋白互作激酶家族(calcineurinB-likeinteractingproteinkinase,CIPK)基因的表达[4]。研究了水稻基因组的突变钙调神经磷酸酶B样蛋白互作激酶(CIPKs)基因(OsCIPK01-OsCIPK30)对多种非生物胁迫的转录应答,结果说明有20个OsCIPK基因受到干旱、盐害等胁迫因素诱导。为寻找对胁迫耐受改良有用的胁迫应答基因,他们在水稻中以玉米泛素启动子控制,过量表达了三种CIPK基因(OsCIPK03,OsCIPK12,OsCIPK15)。在寒冷和干旱的胁迫下,过度表达CIPK03和CIPK12的植物累积脯氨酸和可溶性糖的含量明显比野生型高,脯氨酸合成酶和转运蛋白基因表达水平也比野生型高。这三种基因的过量表达明显增加了转基因水稻对盐胁迫的耐受性。ZmCBL4是从玉米中克隆的新的CBL基因,Wang等[8]利用35S启动子在拟南芥液泡中过量表达ZmCBL4,发现它不仅能够互补拟南芥sos3突变体对盐的超敏性,而且能够提高野生型拟南芥在发芽和幼苗阶段对盐的抗性。1.2过量表达乙烯应答相关基因增加转基因植物的耐盐性Khan等[9]发现乙烯参与了水稻对盐害的胁迫应答。烟草有两种乙烯受体,由nthk1和nthk2两种基因编码,在Mn2+和Ca2+存在时,NTHK1(I型乙烯受体)具有Ser/Thr激酶活性,NTHK2(II型乙烯受体)具有Ser/Thr激酶及His激酶活性。NTHK1基因(Nicotianatabacumhistidinekinase1)编码烟草组氨酸激酶1,Cao等[6]用双35s启动子控制使其在拟南芥中表达,发现NTHK1基因的过表达可以激活盐应答基因AtERF4和Cor6.6的表达,并且转基因后NTHK1mRNA在盐胁迫下积累,而且在盐胁迫下,转NTHK1基因植物的表型、电解质渗透和根生长情况都优于对照植物。Gao等[11]在水稻研究植物耐盐性改良中,用CaMV35s启动子控制过表达番茄乙烯应答因子ERF(ethyleneresponsefactor)蛋白基因TERF1,发现转基因植物对干旱和高盐胁迫的耐受增强,而且TERF1能够有效调控其他胁迫相关功能基因Lip1、Wcor413-1和OsPrx的表达。Lee用CaMV35s启动子控制在马铃薯中过表达乙烯应答元件结合蛋白StEREBP1(Ethyleneresponsiveelementbindingprotein)基因,在长时间75mmol/LNaCl处理下后转基因植物仍能正常生长,他们认为StEREBP1是参与植物盐胁迫应答的一个功能性转录因子[12]。JERF3(jasmonateandethylene-responsivefactor3)基因编码酵母茉莉酸及乙烯应答因子,Wang等[13]用35s启动子在烟草细胞核中组成型表达该基因,之后用300mmol/LNaCl处理转基因植物和野生型植物72h,野生型植物叶片变白,转基因植物仍然保持绿色,而且叶绿素含量也高于野生型植物,因此JERF3能在乙烯信号通路及盐胁迫耐受信号通路中期联结作用。2利用植物离子通道蛋白基因提高植物的耐盐性许多耐盐植物还能利用离子通道应答盐害胁迫,依靠细胞内离子和溶质分子的主动运输维持细胞膨压,保护细胞免受盐害[14]。常用的植物离子通道蛋白有Na+/K+反向转运蛋白及Na+/H+反向转运蛋白[14~23]。2.1过量表达Na+/K+反向转运蛋白基因提高转基因植物的耐盐性Na+/K+反向转运蛋白是一种常见的植物离子通道。在胞质中,Na+和K+经常存在竞争结合位点的现象,Na+浓度过高或者Na+/K+过高都会导致一些酶促代谢反应中断,所以,维持低水平Na+/K+是植物耐盐的基本要求[14]。K+通道和K+转运系统对高等植物有很多作用,它们可以控制植物气孔的关闭、根中离子浓度的上升等。高亲和性K+转运蛋白(highaffinityK+transporter,HKT)可以调节胞质中的Na+/K+,参与水稻和拟南芥的胁迫应答[15]。Obata等[16]利用酵母的功能互补筛选了一个水稻全长cDNA表达文库,他们发现一个表达的cDNA克隆kat1,该基因编码水稻shakerK+通道蛋白。他们在泛素基因启动子控制下在水稻细胞中过表达OsKAT1基因,该基因仅在植物节间及叶轴部位表达,水稻细胞过表达该基因后,与转基因空载体的对照相比,发现盐胁迫下转OsKAT1基因植物细胞内K+含量提高,Na+含量不变,Na+/K+明显下降,他们认为kat1基因能和其他的钾离子通道蛋白协同作用,影响植物耐盐性。2.2过量表达Na+/H+反向转运蛋白基因提高转基因植物的耐盐性Na+/H+反向转运蛋白是另一种应答盐害胁迫的离子通道,该转运蛋白定位于液泡膜,可以维持植物的渗透压。液泡型Na+/H+阳离子反向转运蛋白可以利用液泡中H+移位酶、H+-ATPase和H+-PPiase之间的协同作用,产生电化学梯度,将Na+从胞质主动运输至液泡中[17]。Na+/H+反向转运蛋白基因在小麦和拟南芥等模式植物中都已经克隆到。AtNHX1是一个拟南芥液泡型Na+/K+反向转运蛋白,Zhao等[18]用泛素启动子控制在高牛毛草中过表达ANtHX1基因,在200mmol/LNaCl溶液中处理时与对照比转ANtHX1基因植物的耐盐性强,根里的钠含量高,说明液泡Na+/K+反向转运蛋白介导Na+在根细胞液泡中积累,降低盐对高牛毛草的毒害。Chen等[19]在CaMV35s启动子控制下把拟南芥ANtHX1基因转入荞麦,转基因植物能在200mmol/LNaCl条件下发育、开花,同时,转基因荞麦中的各种主要营养成分含量未受高盐土壤影响。Zhou等[20]以CaMV35s启动子驱动液泡型SeNHX1基因和甜菜碱合成酶BADH基因协同转入烟草,在200mmol/LNaCl胁迫下,转基因植物中钠离子含量高于对照,光合作用速率和光系统Ⅱ的活性受到盐胁迫的影响也比野生型植物小。Qiao等[21]用CaMV35s启动子控制长穗偃麦草的AeNHX1基因转化拟南芥,并使其在液泡膜表达,提高了转基因植物的耐盐性,改良了植物的渗透调节和光合作用,并保证植物在盐害胁迫下正常发育。Brini等[22]在双启动子(P2X35s)控制下将小麦的TNHX1基因转入拟南芥,转基因株在200mmol/LNaCl下长势良好,而野生型出现生长抑制、叶片大面积枯萎等现象。与野生型相比,转基因植物叶组织中的钠离子和钾离子含量增加,胞质中钠离子积累产生的毒效应减弱,水损失速率下降,液泡中溶质积累水平提高。3利用小分子渗透剂合成蛋白基因提高植物的耐盐性植物的小分子渗透剂可以平衡液泡中的水势,保护胞内的生物大分子,协调细胞和外界的渗透压平衡,为细菌、植物和动物提供渗透保护,并在体外的严酷条件下保护细胞组分[23]。常见的植物小分子渗透剂包括甜菜碱和海藻糖等[23~32]。3.1过量表达甜菜碱合成基因提高转基因植物的耐盐性甜菜碱是细菌、植物和动物细胞渗透保护剂,在体外的严酷条件下可以保护细胞组分免受盐害。但是甜菜碱在多数经济作物中合成量都很低,甜菜碱的生物合成首先是由胆碱在胆碱单氧化酶(cholinemonooxygenase,CMO)作用下形成甜菜碱醛,随后在甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehedehrogenase,BADH)催化下形成甜菜碱[24]。codA基因是土壤细菌藤黄节杆菌的胆碱氧化酶基因,Sakamoto等[25]以35sRNA启动子驱动将其导入水稻,提高其合成甜菜碱的能力。转基因植物的胆碱氧化酶分别定位在叶绿体(ChlCOD)和胞质(CytCOD),其甜菜碱水平分别达到1和5μmol/g叶鲜重,以0.15mol/LNaCl处理野生型和转基因植物后消除盐压,转基因植物恢复正常生长速度的时间比野生型要少得多。Zhang等[26]用核糖体RNA启动子控制将甜菜胆碱单氧化酶基因BvCMO转入烟草,转基因植物叶片、根及种子中的甘氨酸甜菜碱含量提高,对盐害胁迫的耐受性增强,光系统II活性的下降程度也不如野生型明显。Kumar等[27]用转基因的方式研究胡萝卜的耐盐性改良,他们用16srRNA启动子将甜菜碱醛脱氢酶BADH基因导入胡萝卜后发现,与非转基因植物相比,转基因植物在100mmol/LNaCl处理下,甜菜碱醛脱氢酶活性增强8倍,甜菜碱积累水平增加了50~54倍,甚至在NaCl浓度达到400mmol/L时,转基因植物还能生长[27]。Li等[28]用辽宁碱蓬BADH基因转化烟草,转基因植物在200mmol/LNaCl胁迫下仍能正常生长并表现甜菜碱醛脱氢酶活性,而非转化株处理20天即黄化、死亡。Liang等[29]用CaMV35s启动子和polyA信号序列控制菠菜的BADH基因,将其转入烟草,转基因植株能够正常表达BADH基因,BADH基因表达水平高的转基因植株,其耐盐性也高。3.2过量表达海藻糖合成酶基因提高转基因植物的耐盐性海藻糖是葡萄糖的一种非还原性二糖,在细菌、真菌和无脊椎动物受到非生物胁迫时,它作为一种相容性溶质稳定生物结构。海藻糖是通过两步反应合成的:首先是UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸在海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)的催化下生成海藻糖-6-磷酸,然后海藻糖-6-磷酸在海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)的催化下转变成海藻糖。除了具有干燥耐受性的复苏植物外,在大多数植物中海藻糖积累量都很低[30]。Cortina等[31]在研究中发现,用CaMV35s启动子及增强子控制酵母的海藻糖-6-磷酸合成酶基因(tps1)在番茄中过表达后,在NaCl胁迫条件下,野生型植物发生严重的渗透胁迫症状,出现萎蔫,矮化,叶绿素缺失等现象,但转基因植物的变化不大;在LiCl胁迫条件下,Li+的毒性使得野生型植物叶片卷曲且出现杂色斑,而转基因植物发生类似情况的很少。OsTPP1是水稻的海藻糖-6-磷酸磷酸酶编码基因,Ge等[32]在不同种的水稻中用CaMV35s启动子驱动过表达该基因,